一种快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系制造技术

本发明专利技术属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系。通过设计的特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，根据是否有目的条带的出现定性判断检测对象是否含有轮虫弧菌。本发明专利技术提供了建立一种轮虫弧菌特异性的RPA反应体系和反应方法，为开发能够在养殖现场进行应用的轮虫弧菌RPA检测技术奠定基础；基于上述体系还可以进一步开发轮虫弧菌的RPA检测技术，从而为养殖生产中有效防控轮虫弧菌的感染提供保障技术。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系
本专利技术属于海水养殖病害防控
，具体涉及一种快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系。
技术介绍
轮虫弧菌(Vibriorotiferianus)隶属于弧菌属，2003年由Gomez-Gil首次将其与坎贝弧菌(Vibriocampbellii)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)等其他弧菌区分，作为一个新种并确定了其标准菌株。近几年来，轮虫弧菌感染水产动物发病的报道日渐增多，2011年Chowdhury等报道了一株可引起青蟹幼蟹患病的轮虫弧菌。2012年，陈政强等从患病的半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)分离得到一株轮虫弧菌，证实该菌可引起半滑舌鳎皮肤溃疡症。2019年，王凯等从患皮肤溃疡症的许氏平鲉中分离出轮虫弧菌，通过人工回接感染实验证实该菌对许氏平鲉具有较强的致病力，是许氏平鲉皮肤溃疡症的致病原。这些文献报道表明，轮虫弧菌已经成为我国水产养殖动物重要的新发病原之一。鉴于轮虫弧菌对我国海水养殖产业的巨大威胁，积极开展其防控技术研究是目前养殖产业所急需的，而实现精准、快速的轮虫弧菌检测是第一步。但轮虫弧菌不能发酵蔗糖，在TCBS培养基上生长的菌落为绿色，无法使用培养基进行快速定性鉴定。因此，实用化的轮虫弧菌检测是当前产业急需突破的关键技术之一。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是最新的核酸等温扩增技术之一，在常温下即可完成对目的片段DNA的扩增，且时间仅需20～30min，具有检测成本低、便于携带等显著优势，非常适合用于病原菌的现场检测技术研发。而针对不同病原菌，筛选特异性的引物和建立高效的反应体系，则是实现RPA检测的基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是轮虫弧菌因为无法使用培养基进行快速定性鉴定，所以如何快速检测是当前产业急需突破的关键技术之一。为解决上述问题，我们提供了建立一种轮虫弧菌特异性的RPA反应体系和反应方法，为开发能够在养殖现场进行应用的轮虫弧菌RPA检测技术奠定基础；基于上述体系还可以进一步开发轮虫弧菌的RPA检测技术，从而为养殖生产中有效防控轮虫弧菌的感染提供保障技术。为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系，通过设计的特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，根据是否有目的条带的出现定性判断检测对象是否含有轮虫弧菌。进一步的，所述特异性引物是基于轮虫弧菌toxR基因设计的，分别为DNA正向序列：VRF：5’-CACTCCAACGTCTGAGCCAAATGCCGAGCT-3’和反向序列VRR：5’-ACGGGTACACCGCTAAACTCTGCAATTTGG-3’；运用该特异性引物扩增的toxR基因部分目的片段长度为300bp。这两个引物序列是我们在测定轮虫弧菌的全基因组序列后，通过对基因组数据的分析，筛选toxR基因的部分序列作为目标片段(划线部分，其中斜体部分为本专利技术的引物)。轮虫弧菌的toxR基因序列全长如下：ATGACTAACATCGGCACCAAATTCCTACTTGCTCAAAGGTTTATCTTTGACCCAAATAGCAATTCTCTCGCTGACCAACAAAGTGGCAATGAAGTTGTTCGCTTAGGAAGCAATGAAAGTCGAATTCTGCTTATGCTTTCAGAGAGACCAAATGAAGTATTAACCCGCCATGAGCTCCATGAGTTTGTTTGGCGAGATCAAGGCTTTGAGGTGGATGACTCAAGCCTAACTCAAGCGATTTCTACATTGCGCAAAATGTTGAAGGACTCAACAAAATCCCCCGAGTTTGTAAAAACGGTACCTAAACGCGGCTATCAGTTGATTTGTAGTGTCGAAAGAATGAGCACTCCAACGTCTGAGCCAAATGCCGAGCTTGAAGATATCGACGCTGAAGAAAGCACTTTTGAAAGTGTTACCGAAGAGATTCAAGCGCAACCGCAGGTTGAAGACTCTGTATCAACAGATCCAAGCTCAGTAAGCGACAACGCAACACCACTTTCAGCGGCAAAAGTAAGTTCAAAAAACAACTGGTTCACGCGTGCCATTTTATTCGTTGCTGTACTGCTGCCAATCATCGTCTTTACCCTCACTAAACCAGCTGAATCTCAATTTCGCCAAATTGCAGAGTTTAGCGGTGTACCCGTTATGACTCCGGCAAACCACCCTCAATTGATGCAGTGGATGCCTTCCATCGAGCAATGTGTTGCTCGATACGTAGAAAATCATACAAACGATGTAATGCCAGTGAAAGTTATCGCTACTGGAGGTCAAGGTAATAAGCTTGTATTGAACTACATTCACGATACGGACCATTCATATGAAAATGTGACATTGCGTATTTTTGCTGGTCAAAACGACCCAACTGACATCTGCAAATAA将该序列在NCBI上进行Blast比对，结果显示与之相似的前8种序列全部来自于轮虫弧菌，并且序列相似度全部都在99％左右(见图1，其中Evalue＝0)，充分证明toxR基因序列是适合用于将轮虫弧菌和其他细菌区分开的靶标序列。我们针对这段序列，用生物学软件设计不同的特异引物，通过PCR反复验证后获得的一对特异性最好的引物，扩增了其中长度为300bp的序列(上述toxR基因序列中下划线的部分，其中标粗分别为正向引物和反向引物)，约占toxR基因全长序列的34.1％，足以用于轮虫弧菌的检测鉴定，这是本项专利技术得以实施的技术基础。同时，我们将所设计的引物序列在NCBI的Primer-Blast中进行了引物通用性的Blast比对，结果发现与NCBI数据库中的轮虫弧菌基因组能够完全匹配(图2)，证明其对轮虫弧菌具有很好的特异性。toxR基因广泛分布于弧菌科细菌，最先在霍乱弧菌(Vibriocholerae)中发现。目前，已在副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、拟态弧菌(Vibrio.mimicus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)等多种弧菌中都发现toxR基因的存在。同时，异种之间的toxR基因核苷酸序列相似性较低，是弧菌科种间鉴定理想的分子靶标。进一步的，用于检测的RPA反应体系总体积为46.5μL，包含2×ReactionBuffer缓冲液25μL，10×BasicE-mix5μL，上述浓度为10μM的VRF和VRR引物各2.4μL，dNTP酶9.2μL，20×CoreReactionMix2.5μL。进一步的，上述反应体系的制备方法包括以下步骤：(1)在无菌的200μLPCR管中分别加入浓度10μM的轮虫弧菌正向引物VRF和反向引物VRR各2.4μL。...

【技术保护点】
1.一种快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系，其特征在于：通过设计的特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，根据是否有目的条带的出现定性判断检测对象是否含有轮虫弧菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系，其特征在于：通过设计的特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，根据是否有目的条带的出现定性判断检测对象是否含有轮虫弧菌。


2.如权利要求1所述的快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系，其特征在于：所述特异性引物分别为DNA正向序列：VRF：5’-CACTCCAACGTCTGAGCCAAATGCCGAGCT-3’和反向序列VRR：5’-ACGGGTACACCGCTAAACTCTGCAATTTGG-3’。


3.如权利要求2所述的快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系，其特征在于：所述特异性引物基于轮虫弧菌toxR基因设计，运用该特异性引物扩增的toxR基因部分目的片段长度为300bp。


4.如权利要求2所述的快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系，其特征在于：用于检测的RPA反应体系总体积为46.5μL，包含2×ReactionBuffer缓冲液25μL，10×BasicE-mix5μL，上述浓度为10μM的VRF和VRR引物各2.4μL，dNTP酶9.2μL，20×CoreReactionMix2.5μL。


5.一种权利要求1所述的快速检测轮虫弧菌的RPA反应体系制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张正，陈京，于永翔，王印庚，荣小军，廖梅杰，张浩，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37