用于检测淋病奈瑟球菌的荧光定量PCR方法及相应的检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了用于检测淋病奈瑟球菌的荧光定量PCR方法及相应的检测试剂盒。本发明专利技术巧妙的应用了特异性的基因检测区分淋病奈瑟菌属与其它奈瑟菌属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明专利技术与现有的主流检测试剂盒相比，本发明专利技术用于检测淋病奈瑟菌试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测淋病奈瑟球菌的荧光定量PCR方法及相应的检测试剂盒
本专利技术属于分子检测
，具体涉及一种通过特异性基因对淋病奈瑟球菌进行荧光定量PCR的检测方法及相应的检测试剂盒。
技术介绍
淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)呈卵圆或豆状，常成双排列，邻近面扁平或稍凹，像两瓣黄豆对在一起，大小0.6μm×0.8μm。革兰氏染色阴性，呈粉红色，美蓝染色呈蓝色。急性炎症期淋病奈瑟球菌多在患者分泌物的少部分中性粒细胞的胞浆中，慢性期则多在细胞外，且有些可呈单个球形或四联状。淋病奈瑟球菌人工培养后形态亦常呈球形、单个、成双或四联排列。淋病奈瑟球菌是严格的人体寄生菌，常存在于急性尿道炎与阴道炎的脓性分泌物的白细胞中，形态染色类似于脑膜炎球菌。淋病奈瑟球菌感染可引起泌尿生殖系统的化脓性感染，是常见的性传播疾病之一，俗称淋病。临床表现以尿道炎、宫颈炎多见，典型症状是排尿困难、尿频、尿急、尿痛、排出黏液或脓性分泌物等。也可侵犯眼睛、咽部、直肠和盆腔等处以及血行播散性感染引起关节炎、肝周炎、败血症、心内膜炎或脑膜炎等。淋病奈瑟球菌微生物学检查主要是采取尿道脓性分泌物涂片，革兰氏染色镜检，如在中性粒细胞中发现革兰氏阴性双球菌时，有诊断价值，必要时进行分离培养。淋病奈瑟球菌分离培养法的灵敏度不高，极大地降低了诊断结果的可靠性。因此，寻找一种快速、灵敏并且适用于临床诊断的检测方法已显得非常紧要。近年来，丰富的基因组数据为分子诊断技术锁定淋病奈瑟球菌特异性序列提供了参考数据库。当前，分子生物学技术正以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于淋病奈瑟球菌的诊断检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于检测产毒淋病奈瑟球菌的荧光定量PCR方法。具体地，上述方法包括如下步骤：S1、收集样品；S2、提取基因组DNA；S3、检测淋病奈瑟球菌属特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB；S4、读取扩增Ct值；当所述淋病奈瑟球菌属特异性基因中至少1个基因Ct值小于35时，淋病奈瑟球菌的检测结果为阳性；当所述淋病奈瑟球菌属特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的Ct值大于35时，淋病奈瑟球菌的检测结果为阴性。作为一种优选技术方案，所述淋病奈瑟球菌属特异性基因gene1的检测引物如SEQIDNO:1～2所示：SEQIDNO:1(5'-CCCAATCCAAAAGCGATGCC-3')(NCBIAccessionNumber：QBK53603.1)；SEQIDNO:2(5'-TCCCAGACTGATATTGCGCC-3')(NCBIAccessionNumber：QBK53604.1)。所述淋病奈瑟球菌属特异性基因gene2(NCBIAccessionNumber：QBK53378.1)的检测引物如SEQIDNO:3～4所示：SEQIDNO:3(5'-TCCTGACCGACATCCTTTGC-3')；SEQIDNO:4(5'-GACAAAGCCCCTACAGGTCC-3')。所述淋病奈瑟球菌属特异性基因gene3(NCBIAccessionNumber：QBK53377.1)的检测引物如SEQIDNO:5～6所示：SEQIDNO:5(5'-AGAATGGGTCGGAAGCAAGG-3')；SEQIDNO:6(5'-ATGGCAGTCTTCTCCGCATT-3')。所述淋病奈瑟球菌属特异性基因gene4的检测引物如SEQIDNO:7～8所示：SEQIDNO:7(5'-CGCTTGATTTGCCTGTGGTT-3')(NCBIAccessionNumber：AZG69323.1)；SEQIDNO:8(5'-GTTCTTGCTTGCGTACTGGC-3')(NCBIAccessionNumber：AZG69324.1)。所述淋病奈瑟球菌属特异性基因rpoB(NCBIAccessionNumber：RPSN01000039.1)的检测引物如SEQIDNO:9～10所示：SEQIDNO:9(5'-CAATACCTTGCGCACGGATG-3')；SEQIDNO:10(5'-TGTTGGGCTTCGGACAGTTT-3')。本专利技术的另一目的是提供一种用于检测淋病奈瑟球菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的淋病奈瑟球菌属特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的检测引物。与现有技术相比，本专利具有如下有益效果：(1)本专利技术通过前期对淋病奈瑟菌属和其他奈瑟菌属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分淋病奈瑟菌属和其他奈瑟菌属的特异性基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出样品中是否含有淋病奈瑟菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。(2)本专利技术中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。(3)本专利技术能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。(4)本专利技术检测方法能够应用于对于阴道分泌物、皮肤分泌物、尿液等各个来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有淋病奈瑟菌，操作方便、快速、灵敏。本专利技术检测试剂盒能够应用于医学等方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。附图说明图1是rpoB基因检测引物标准曲线。图2的gene1基因检测引物标准曲线。图3是gene2基因检测引物标准曲线。图4是gene3基因检测引物标准曲线。图5是gene4基因检测引物标准曲线。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本专利技术所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。表1在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本专利技术所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测淋病奈瑟球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、收集样品；/nS2、提取基因组DNA；/nS3、检测淋病奈瑟球菌属特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB；/nS4、读取扩增Ct值；当所述淋病奈瑟球菌属特异性基因中至少1个基因Ct值小于35时，淋病奈瑟球菌的检测结果为阳性；当所述淋病奈瑟球菌属特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的Ct值大于35时，淋病奈瑟球菌的检测结果为阴性。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测淋病奈瑟球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测淋病奈瑟球菌属特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB；
S4、读取扩增Ct值；当所述淋病奈瑟球菌属特异性基因中至少1个基因Ct值小于35时，淋病奈瑟球菌的检测结果为阳性；当所述淋病奈瑟球菌属特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的Ct值大于35时，淋病奈瑟球菌的检测结果为阴性。


2.根据权利要求1所述的用于检测淋病奈瑟球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述淋病奈瑟球菌属特异性基因gene1的检测引物如SEQIDNO:1～2所示。


3.根据权利要求1所述的用于检测淋病奈瑟球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述淋病奈瑟球菌属特异性基...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹亮，张智闵，连政汉，蒋华，束文圣，
申请(专利权)人：广东美格基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44