一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉制造技术

本发明专利技术属于食品检测技术领域，具体涉及一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉。该冻干粉以prfA、hlyA毒力基因作为检测用目标基因，具体制备步骤包括：提取全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增、与pLB质粒连接、转化、筛选、鉴定并提取质粒、制备冻干粉成品等步骤。本申请中，发明专利技术人以现有若干菌株作为标准菌株，以若干毒力基因作为目标基因，利用基因工程技术手段，以pLB质粒作为载体，构建了含有目标毒力基因的标准化质粒样品。利用该标准品，可为相关食源性单增李斯特菌的快速检测和鉴定奠定良好技术基础，无论对于单增李斯特菌标准化检测体系建立、抑或对于确保食品安全，都具有十分重要的技术价值和应用意义。

【技术实现步骤摘要】
一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉
本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉。
技术介绍
随着人们生活水平的不断提高，人们对于食品安全问题日益重视。在食品安全问题中，食源性微生物所导致的食品质量问题一直居于首位，而由食源性微生物所引起的食源性疾病已经成为最重要的世界性卫生疾病问题之一。受限于技术实际和其他客观条件，现阶段我国检测食源性微生物时，即时性检测时，由于定性检验DNA参考物质体系尚不不完整，因此大大限制了检验检测的技术水平。单核细胞增生李斯特菌（简称单增李斯特菌）(Listeriamonocytogenes，LM)是一种革兰氏染色阳性菌，因其繁殖和生存能力强大，在自然界中存在广泛，因此，也是人类生活中一种常见的食源性致病菌。其可通过李斯特菌溶血素、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和卵磷脂酶的裂解作用逃离吞噬小体，并在细胞质中增殖。感染时可引发肠胃炎、脑膜炎、免疫缺陷、新生儿及孕妇败血症等疾病，严重者甚至可导致死亡。现有技术中，对于单增李斯特氏菌主要检测方法有：传统的培养方法，这种方法需要本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，该冻干粉以prfA、hlyA毒力基因作为检测用目标基因，采用如下步骤制备获得：/n（一）提取全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增/n提取李斯特菌菌体的总DNA时；/n针对不同毒力基因，设计PCR扩增用引物序列如下：/nprfA –F1：5’- GATACAGAAACATCGGTTGGC-3’，/nprfA –R1：5’- GTGTAATCTTGATGCCATCAG-3’；/n扩增产物274bp；/nhlyA-F：5’- CCTAAGACGCCAATCGAA-3’，/nhlyA-R：5’- AAGCGCTTGCAACTGCTC-3’；/n扩...

【技术特征摘要】
1.一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，该冻干粉以prfA、hlyA毒力基因作为检测用目标基因，采用如下步骤制备获得：
（一）提取全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增
提取李斯特菌菌体的总DNA时；
针对不同毒力基因，设计PCR扩增用引物序列如下：
prfA–F1：5’-GATACAGAAACATCGGTTGGC-3’，
prfA–R1：5’-GTGTAATCTTGATGCCATCAG-3’；
扩增产物274bp；
hlyA-F：5’-CCTAAGACGCCAATCGAA-3’，
hlyA-R：5’-AAGCGCTTGCAACTGCTC-3’；
扩增产物702bp；
prfA-F2：5’-GAATGTAAACTTCGGCGCGAATCAG-3’，
prfA-R2：5’-GCCGTCGATGATTTGAACTTCATC-3’；
扩增产物388bp；
以所提取的全基因组DNA为模板，利用上述引物进行序列扩增对PCR扩增产物进行回收、纯化备用；
（二）连接、转化
以pLB质粒作为连接载体，将步骤（一）中的扩增产物分别与pLB质粒进行连接，并进行转化；
（三）筛选、鉴定并提取质粒
对步骤（二）中的转化产物进一步提取质粒进行鉴定，对鉴定正确的菌株进行传代培养，并最终提取质粒备用；
（四）制备冻干粉成品
将步骤（三）所制备质粒进一步制备成冻干粉，即为评价李斯特菌致病性时的标准化质粒标准品。


2.如权利要求1所述检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，步骤（一）中，所述李斯特菌以单增李斯特菌1862、单增李斯特氏菌ATCC19115、单增李斯特氏菌CICC21633、英诺克李斯特ATCC33090或英诺克李斯特FC11260为标准菌株。


3.如权利要求1所述检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，步骤（一）中...

【专利技术属性】
技术研发人员：郜晓峰，康文艺，崔生辉，马盼盼，马常阳，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41