一种快速检测食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉制造技术

本发明专利技术属于食品检测技术领域，具体涉及一种快速检测食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉。具体制备时，包括：提取大肠杆菌全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增、连接、转化、筛选、鉴定并提取质粒、制备冻干粉成品等步骤。本申请中，发明专利技术人以现有特定的几种大肠杆菌菌株的escV、stx2、bfpA、hlyA、rfb、uid、stx2和eaeA等毒力基因作为目标基因，利用基因工程技术手段，以pLB质粒作为载体，构建了含有目标毒力基因的标准化质粒样品。利用该标准品，可为相关食源性大肠杆菌的快速检测和鉴定奠定良好技术基础，无论对于大肠杆菌标准化检测体系建立、抑或对于确保食品安全，都具有十分重要的技术价值和应用意义。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉
本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种快速检测食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉。
技术介绍
随着人们生活水平的不断提高，人们对于食品安全问题日益重视。在食品安全问题中，食源性微生物所导致的食品质量问题一直居于首位，而由食源性微生物所引起的食源性疾病已经成为最重要的世界性卫生疾病问题之一。受限于技术实际和其他客观条件，现阶段我国检测食源性微生物时，即时性检测时，由于定性检验DNA参考物质体系尚不不完整，因此大大限制了检验检测的技术水平。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，通常也称为大肠杆菌，能够感染水源、食物后引起食物中毒，严重者甚至死亡。作为食源性微生物中主要的和最为常见致病菌之一，在食品卫生以及流行病学领域，大肠杆菌也是重要的基础性研究对象。而根据不同的生物学特性，一般将致病性大肠杆菌分为6类：肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)和弥散粘附性大肠杆菌(DAEC)。对大肠杆菌的基因组研究表明，大肠杆菌中的志贺样毒素基因（stx1和stx2）、紧密素(eae)、溶血素(hly)基因以及O抗原编码基因(rfb)、β-葡糖醛酸糖苷酶基因（uid）等毒力基因是主要的致病基因。因此，如能开发一种针对致病大肠杆菌毒力基因检测用标准品，对于相关致病菌的即时、快速检测具有十分重要的技术意义。
技术实现思路
本申请目的在于提供一种检测食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉，以此作为标准品应用时，可为大肠杆菌的快速、即时检测体系的建立和食品安全奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一种快速检测食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉，以食源性致病菌大肠杆菌FCO157、CMCC43201(中国医学细菌保藏管理中心)、ATCC25922（美国菌种保藏中心）以及致泻大肠杆菌CICC10372（中国工业微生物菌种保藏管理中心）这四种菌株为例，以escV（蛋白分泌物调节基因）毒力基因、Stx2（志贺毒素Ⅱ）毒力基因、bfpA（束状菌毛A）、hlyA（溶血素基因）、rfb（O抗原编码基因）、uid（β-葡萄糖苷酶）、和eaeA（紧密素）为目标毒力基因，以pLB质粒作为载体质粒，通过基因工程技术手段，转化制备成含有目标毒力基因的标准品，从而为致病菌标准化检测体系奠定基础，具体步骤如下：（一）提取大肠杆菌全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增利用现有细菌基因组DNA提取试剂盒，参考其说明书，提取大肠杆菌全基因组DNA备用；针对目标毒力基因escV、stx2、bfpA、hlyA、rfb、uid和eaeA，分别设计PCR扩增用引物序列如下：escV-F：5’-ATTCTGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3’，escV-R：5’-CGTCCCCTTTTACAAACTTCATCGC-3’；Stx2--F：5’-GTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAG-3’，Stx2--R：5’-AGCGTAAGGCTTCTGCTGTGAC-3’；bfpA-F：5’-GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3’，bfpA-R：5’-GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3’；HlyA-F：5’-CACACGGAGCTTATAATATTCTGTCA-3’，HlyA-R：5’-AATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT-3’；rfb-F：5’-AGGACCGCAGAGGAAAGAGAGGAATTA-3’，rfb-R：5’-ATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGT-3’；uid-F：5’-GCGAAAACTGTGGAATTGGG-3’，uid-R：5’-TGATGCTCCATCACTTCCTG-3’；eaeA-F：5’-GGAACGGCAGAGGTTAATCTGCAG-3’，eaeA-R：5’-GGCGCTCATCATAGTCTTTC-3’；以所提取的大肠杆菌全基因组DNA为模板，利用上述引物进行序列扩增；对PCR扩增产物进行回收、纯化备用；（二）连接、转化以pLB质粒作为连接载体，将步骤（一）中的扩增产物分别与pLB质粒进行连接，并进行转化；（三）筛选、鉴定并提取质粒对步骤（二）中的转化产物进一步提取质粒进行鉴定，对鉴定正确的菌株进行传代培养，并最终提取质粒备用；（四）制备冻干粉成品配合赋形剂、保护剂，将步骤（三）所制备质粒进一步制备成冻干粉，即为评价大肠杆菌致病性时的标准化质粒标准品（即作为对照品应用）。所述食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉在食品检测中应用，具体用于检测枸杞，作为阳性对照，用于判定枸杞是否受到致病性大肠杆菌污染。利用所述食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉的大肠杆菌检测方法，包括如下步骤：（一）处理样品对检测样品进行处理，提取待检测样品中微生物DNA；（二）设计引物并进行PCR扩增具体引物序列同前述，即具体为：escV-F：5’-ATTCTGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3’，escV-R：5’-CGTCCCCTTTTACAAACTTCATCGC-3’；Stx2--F：5’-GTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAG-3’，Stx2--R：5’-AGCGTAAGGCTTCTGCTGTGAC-3’；bfpA-F：5’-GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3’，bfpA-R：5’-GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3’；HlyA-F：5’-CACACGGAGCTTATAATATTCTGTCA-3’，HlyA-R：5’-AATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT-3’；rfb-F：5’-AGGACCGCAGAGGAAAGAGAGGAATTA-3’，rfb-R：5’-ATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGT-3’；uid-F：5’-GCGAAAACTGTGGAATTGGG-3’，uid-R：5’-TGATGCTCCATCACTTCCTG-3’；eaeA-F：5’-GGAACGGCAGAGGTTAATCTGCAG-3’，eaeA-R：5’-GGCGCTCATCATAGTCTTTC-3’；以步骤（一）中所提取微生物DNA为模板，分别利用上述引物对中一对、两对或者任意几对进行PCR扩增，以此作为检测样；同时，利用李斯特菌用标准化质粒冻干粉作为模板，分别利用上述引物对中一对、两对或者任意几对进行PCR扩增，以此作为标准样；（三）本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，利用如下步骤制备获得，/n（一）提取大肠杆菌全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增/n提取大肠杆菌全基因组DNA备用；/n同时针对目标毒力基因escV、stx2、bfpA、hlyA、rfb、uid和eaeA，分别设计PCR扩增用引物序列如下：/nescV-F：5’- ATTCTGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3’，/nescV-R：5’- CGTCCCCTTTTACAAACTTCATCGC-3’；/nStx2--F：5’- GTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAG-3’，/nStx2--R：5’- AGCGTAAGGCTTCTGCTGTGAC-3’；/nbfpA-F：5’- GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3’，/nbfpA-R：5’- GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3’；/nHlyA-F：5’- CACACGGAGCTTATAATATTCTGTCA-3’，/nHlyA-R：5’- AATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT-3’；/nrfb-F：5’- AGGACCGCAGAGGAAAGAGAGGAATTA-3’，/nrfb-R：5’- ATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGT-3’；/nuid-F：5’- GCGAAAACTGTGGAATTGGG-3’，/nuid-R：5’- TGATGCTCCATCACTTCCTG-3’；/neaeA-F：5’- GGAACGGCAGAGGTTAATCTGCAG-3’，/neaeA-R：5’- GGCGCTCATCATAGTCTTTC-3’；/n以所提取的大肠杆菌全基因组DNA为模板，利用上述引物进行序列扩增；/n对PCR扩增产物进行回收、纯化备用；/n（二）连接、转化/n以pLB质粒作为连接载体，将步骤（一）中的扩增产物分别与pLB质粒进行连接，并进行转化；/n（三）筛选、鉴定并提取质粒/n对步骤（二）中的转化产物进一步提取质粒进行鉴定，对鉴定正确的菌株进行传代培养，并最终提取质粒备用；/n（四）制备冻干粉成品/n将步骤（三）所制备质粒进一步制备成冻干粉，即为评价大肠杆菌致病性时的标准化质粒标准品。/n...

【技术特征摘要】
1.一种快速检测食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，利用如下步骤制备获得，
（一）提取大肠杆菌全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增
提取大肠杆菌全基因组DNA备用；
同时针对目标毒力基因escV、stx2、bfpA、hlyA、rfb、uid和eaeA，分别设计PCR扩增用引物序列如下：
escV-F：5’-ATTCTGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3’，
escV-R：5’-CGTCCCCTTTTACAAACTTCATCGC-3’；
Stx2--F：5’-GTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAG-3’，
Stx2--R：5’-AGCGTAAGGCTTCTGCTGTGAC-3’；
bfpA-F：5’-GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3’，
bfpA-R：5’-GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3’；
HlyA-F：5’-CACACGGAGCTTATAATATTCTGTCA-3’，
HlyA-R：5’-AATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT-3’；
rfb-F：5’-AGGACCGCAGAGGAAAGAGAGGAATTA-3’，
rfb-R：5’-ATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGT-3’；
uid-F：5’-GCGAAAACTGTGGAATTGGG-3’，
uid-R：5’-TGATGCTCCATCACTTCCTG-3’；
eaeA-F：5’-GGAACGGCAGAGGTTAATCTGCAG-3’，
eaeA-R：5’-GGCGCTCATCATAGTCTTTC-3’；
以所提取的大肠杆菌全基因组DNA为模板，利用上述引物进行序列扩增；
对PCR扩增产物进行回收、纯化备用；
（二）连接、转化
以pLB质粒作为连接载体，将步骤（一）中的扩增产物分别与pLB质粒进行连接，并进行转化；
（三）筛选、鉴定并提取质粒
对步骤（二）中的转化产物进一步提取质粒进行鉴定，对鉴定正确的菌株进行传代培养，并最终提取质粒备用；
（四）制备冻干粉成品
将步骤（三）所制备质粒进一步制备成冻干粉，即为评价大肠杆菌致病性时的标准化质粒标准品。


2.如权利要求1所述快速检测食源性致病菌大肠杆菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，步骤（1）中，提取大肠杆菌全基因组DNA时，以食源性致病菌大肠杆菌FCO157、CMCC43201、ATCC25922、或者致泻...

【专利技术属性】
技术研发人员：马常阳，郜晓峰，康文艺，崔生辉，夏丹丹，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41