木藜芦毒素III半抗原、人工抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物化工技术领域，具体地说，涉及木藜芦毒素III半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。所述木藜芦毒素III半抗原，结构如下所示：

【技术实现步骤摘要】
木藜芦毒素III半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
本专利技术属于生物化工
，具体地说，涉及木藜芦毒素III半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
杜鹃花科植物广泛分布于南北半球的温带和北半球的亚寒带地区，包含50余属，1700多种。我国杜鹃花科分布较多，其特点是以西南山区为中心，遍布全国。杜鹃花科中有毒植物甚多，高达百余种，尤其是集中在马醉木属、木黎芦属、南烛属、杜鹃花和山月桂属。人畜一旦误食有毒杜鹃，往往出现中毒症状，如呕吐、腹痛、头晕、呼吸困难，严重者还出现昏睡、角弓反涨、呼吸麻痹和惊厥等症状。现代科学研究表明：有毒杜鹃中通常含有一类结构独特的木黎芦烷类毒素，其中以木黎芦毒素III为代表性物质。虽然杜鹃花科植物的毒性很大，但由于它们多为灌木，大多生长在山地林中，因此能够直接构成危害人畜的种类并不是太多。人的中毒往往是发生在部分可供药用或者食用的杜鹃，如大白花杜鹃和金叶子。此外，由于部分有毒杜鹃属于蜜源植物，盛花时节，能够分泌大量的花蜜，由于其花蜜中含有木黎芦毒素III等毒素，它们通过蜜蜂采集行为，迁移并富集在蜂蜜中，形成有毒蜂蜜，即“MadHoney”。土耳其环黑海地区和尼泊尔地区常年发生蜂蜜中毒事件，皆是由食用“MadHoney”引起。如何有效地检测蜂蜜和食用杜鹃花中木黎芦毒素的含量，保障人的生命健康，已经成为食品安全领域亟需解决的难题之一。当前，木黎芦毒素III的检测方法主要是基于高效液相色谱或者液相串联质谱法等仪器分析方法进行检测。仪器分析具有准确度高、灵敏度佳等优点，但是通常需要繁琐的样本前处理过程，而且需要专业的技术人员在实验室进行检测分析，这极大地限制了该技术在实际情况下的应用。基于抗原抗体特异性识别开发的免疫分析方法具有简单、方便、快速、灵敏和特异等优点，尤其是开发的胶体金试纸条非常合适现场的快速检测。在免疫分析方法的构建过程中，优异抗体的获得是关键，一旦有了好了抗体，便可以选择不同的分析策略和模式构建多种免疫分析方法。由于小分子化合物分子量较小，难以刺激机体产生抗体，为此，以目标化合物的化学结构为基础，进行设计与改造成为构建免疫分析方法的核心。
技术实现思路
针对现有木藜芦毒素Ⅲ抗原合成技术的空白，本专利技术提供了木藜芦毒素III半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。具体而言，第一方面，首次公开了一种木黎芦毒素III半抗原，结构如下所示：。本专利技术发现，在木藜芦毒素Ⅲ的C14位羟基位引入长度为4个碳原子间隔臂，在尽可能保持木藜芦毒素Ⅲ结构不变的情况下，得到活泼基团为羧基的半抗原。在该结构下，木藜芦毒素Ⅲ可作为抗原决定簇，暴露于载体蛋白表面，可以很好地刺激机体产生免疫反应，为高灵敏度抗木藜芦毒素Ⅲ抗体的制备奠定基础。第二方面，本专利技术提供所述木藜芦毒素III半抗原的制备方法，包括：将木藜芦毒素Ⅲ与琥珀酸酐在室温下避光反应，即得。在一个优选的实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：用无水吡啶分别溶解木藜芦毒素Ⅲ与琥珀酸酐，将两种溶液混合，于室温220~240rpm避光反应12~13h；反应体系加水淬灭后，用乙酸乙酯萃取，然后用稀盐酸(优选浓度为0.1M)洗涤，有机相干燥浓缩后，获得半抗原的粗品。随后采用半制备液相色谱对获得的粗品进行分离纯化，即可获得目标木藜芦毒素Ⅲ半抗原。第三方面，本专利技术提供一种木藜芦毒素Ⅲ人工抗原，由所述木藜芦毒素Ⅲ半抗原与载体蛋白偶联后得到；其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选BSA和OVA。所述木藜芦毒素Ⅲ人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原，免疫原可以是木藜芦毒素Ⅲ-HS-BSA，包被原可以是木藜芦毒素Ⅲ-HS-OVA。作为优选，在木藜芦毒素Ⅲ人工抗原中，所述木藜芦毒素Ⅲ半抗原与载体蛋白的摩尔比为23~25:1，更优选为23.7:1。第四方面，本专利技术提供所述的木藜芦毒素Ⅲ人工抗原的制备方法，采用活化酯法将载体蛋白偶联于所述木藜芦毒素Ⅲ半抗原的羧基碳上。在一种优选的技术方案中，所述的木藜芦毒素Ⅲ人工抗原的制备方法包括如下步骤：（1）将木藜芦毒素Ⅲ半抗原，NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），DCC（二环己基碳二亚胺）溶解于DMF溶剂中，于室温反应6~8h，得到半抗原活化液。（2）将载体蛋白溶解于PBS中，取步骤（1）制得的半抗原活化液缓慢滴加到载体蛋白溶液中，得到蛋白活化液。（3）将（2）制得蛋白活化液转移到截留分子量为7KDa的透析袋中，将透析袋置于PBS缓冲液中4℃透析2~4天。（4）取出透析袋，将透析袋中的液相离心后收集上清液，即为木藜芦毒素Ⅲ人工抗原溶液。第五方面，本专利技术提供所述的木藜芦毒素Ⅲ半抗原或所述的木藜芦毒素Ⅲ人工抗原在以下任一方面的应用：①在制备木藜芦毒素Ⅲ特异性抗体中的应用；②在检测木藜芦毒素Ⅲ特异性抗体中的应用。进一步的，本专利技术提供木藜芦毒素Ⅲ特异性抗体，以所述的木藜芦毒素Ⅲ人工抗原为免疫原（如Balb/c小鼠，新西兰大白兔，绵羊等，优选Balb/c小鼠），免疫动物制备得到。所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，优选为多克隆抗体。优选地，所述人工抗原由所述木藜芦毒素Ⅲ半抗原与BSA偶联得到。在本专利技术的一个优选的具体实施方式中，免疫Balb/c小鼠的方法为：首次免疫时，免疫原用等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫6-8周龄Balb/c小鼠4只；加强免疫时，用相同剂量的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠。其中，所述首次免疫及加强免疫的所述免疫原的剂量为100µg/只，免疫原浓度为1mg/mL（稀释液为0.01MPBS），乳化后每只Balb/c小鼠的免疫剂量为0.2mL/只。上述加强免疫次数为2次。上述加强免疫具体为在每次免疫后4周各进行一次加强免疫。所述小鼠抗血清即为鼠源多克隆抗体，在第二次加强免疫一周后，眼球静脉采血分离获得血清。在检测血清时，分析测定方法可以为酶联免疫吸附测定法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)。所述ELISA检测方法包括：间接ELISA法，检测木藜芦毒素Ⅲ抗体血清效价；间接竞争ELISA法，测定抗体的半数抑制浓度(IC50)和特异性。第六方面，本专利技术提供所述木藜芦毒素Ⅲ特异性抗体在以下任一方面的应用：（1）在检测木藜芦毒素Ⅲ中的应用；（2）在制备木藜芦毒素Ⅲ的免疫层析试纸条中的应用；（3）在制备木藜芦毒素Ⅲ的酶联免疫分析检测试剂盒中的应用。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：（1）本专利技术首次提供一种新型的木藜芦毒素Ⅲ半抗原、人工抗原及其制备方法，用所述木藜芦毒素Ⅲ人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本专利技术提供的木藜芦毒素Ⅲ-HS及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的木藜芦毒素Ⅲ检测方法提供了新手段。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.木藜芦毒素III半抗原，其特征在于，结构如下所示：/n

【技术特征摘要】
1.木藜芦毒素III半抗原，其特征在于，结构如下所示：

。


2.权利要求1所述木藜芦毒素III半抗原的制备方法，其特征在于，包括：将木藜芦毒素Ⅲ与琥珀酸酐在室温下避光反应，即得。


3.木藜芦毒素Ⅲ人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述木藜芦毒素Ⅲ半抗原与载体蛋白偶联后得到；
其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。


4.根据权利要求3所述的木藜芦毒素Ⅲ人工抗原，其特征在于，所述木藜芦毒素Ⅲ半抗原与载体蛋白的摩尔比为23~25:1。


5.权利要求3所述的木藜芦毒素Ⅲ人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活化酯法将载体蛋白偶联于所述木藜芦毒素Ⅲ半抗原的羧基碳上。


6.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，傅怡，张金震，周金慧，杨宇晖，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11