牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗，其包含作为有效成分的重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白（BVDV‑Fu），所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术的疫苗能够在牛体内产生较强体液免疫，免疫后的牛能够抵御强毒攻毒，并且本发明专利技术的疫苗能够大规模工业化制备，成本低廉，质量稳定，安全性高。

【技术实现步骤摘要】
牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗
本专利技术涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗、其制备方法与应用，属于人用疫苗和人用生物制品领域。
技术介绍
牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)引起的一种急性、接触性传染病。BVDV除感染牛外，还可感染猪、鹿、羊、骆驼及其他野生动物，甚至还有感染人的报道，宿主相当广泛。该病以消化道黏膜糜烂、发热、咳嗽、腹泻以及怀孕母牛流产或产生畸形胎儿为主要特征。一旦感染，可造成持续感染，持续感染的牛处于免疫耐受状态时，临床上不表现任何症状，但仍然带毒、排毒，可严重损坏机体的免疫机能，造成生产性能下降，还可以诱发其他病原体的感染而导致继发感染或混合感染等，急性BVDV致死率可高达90%。BVDV的高突变率以及复杂的临床症状，给全球畜牧产业的发展带来了重大危害和无法估量的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将BVD列入OIEB类动物疫病目录，我国将其列为二类传染病。BVDV是黄病毒科瘟病毒属的成员，为单股正链RNA病毒。BVDV仅有一种血清型，但同一血清型之间存在着显著的遗传和抗原异质性。BVDV5’UTR是高度保守的序列，是BVDV基因型分型的依据，根据BVDV5’UTR序列遗传进化分析分成BVDVI型和BVDVII型两个基因型（HEINZFX，COLLETYMS，PURCELLRH，etal，Familyflaviridae．Virustaxonomy:seventhreportoftheinternationalcommitteeontaxonomyofvirus[M]．SanDiego:AcademicPress，2000:859-878.）。近年来，在牛血清中检测到了非典型性牛的瘟病毒BVDV-Ⅲ基因型，该基因型可分为两个基因亚型（Brazilian源和Thai源），但BVDV-Ⅲ的病毒还未被国际病毒分类委员会确认（BauermannFV,RidpathJF,WeiblenR,etal.HoBi-likeviruses:anemerginggroupofpestiviruses[J].JVetDiagnInvest,2013,25(1):6-15.）。BVDVI型已被国内外广泛地研究报道，它包括很多经典株和多种常见疫苗株，在大多数地区分离的BVDVI型均为低毒力，致病性BVDVI型常引起发热、下痢和急慢性粘膜病。BVDVII型包括高致病力毒株和低致病力毒株，BVDVII型和BVDVI型感染表现的临床症状很相似，但还能引起严重的血小板减少症和出血综合症，另外它还能引起怀孕后期母牛的流产、死胎和新生小牛的先天畸形、免疫抑制等。根据BVDV基因组中5’UTR、Npro和E2序列的比较，BVDVI型可以分为22个亚型(Ia-Iv)；BVDVII型分为4个亚型(2a-2d)。研究证明，不同亚型的抗原不同，中和反应不同，与单克隆抗体的结合不同，牛接种疫苗的反应也不同。BVDV粒子电镜观察病毒颗粒大小40-60nm，呈二十面体对称，有囊膜，病毒衣壳的直径约25-30nm。基因组全长约12.3-12.5kb，包括一个开放阅读框、5’非翻译区(5’UTR)和3’非翻译区(3’UTR)。BVDV通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞，在病毒和宿主的蛋白酶共同水解和切割作用下，会形成12种成熟蛋白，包括P14(Core)、gp48(ERNS)、gp25(E1)和gp53(E2)4种结构蛋白和Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B8种非结构蛋白（BRANZA-NICHITAN,DURANTELD,CARROUEE-DUR-ANTELS,etal.AntiviraleffectofN-butyldeoxynojirimycina-gainstbovineviraldiarrheaviruscorrelateswithmisfoldingofE2envelopeproteinsandimpairmentoftheirassociationintoE1-E2heterodimers[J].JournalofVirology,2001,75(8):3527-3536.）。在这些糖蛋白中，结构蛋白Erns和E2是最具免疫原性的蛋白质。Erns蛋白是一种高度糖基化蛋白质，与受感染的细胞分泌可溶可以抑制核糖核酸酶活性。同时Erns蛋白有少量的中和表位，可以调控宿主的免疫反应。Erns蛋白是一个同源二聚体，诱导机体产生抗Erns的中和抗体（TewsBA,MeyersG.ThepestivirusglycoproteinErnsisanchoredinplaneinthemembraneviaanamphipathichelix.[J].JBiolChem.2007,282(45):32730-32741.）。E2蛋白位于病毒粒子的外表面，含有病毒重要的抗原决定簇，是病毒主要的免疫保护性抗原，能诱导机体产生保护性的中和抗体（HarpinS,DavidJH,MbikayM,eta1.VaccinationofcattlewithaDNAplasmidencodingthebovineviraldiarrhoeavirusmaiorglycoproteinE2[J].JGenVirol,1999,80:3137-3144;KalayciogluAT，RussellPH，HowardCR．ThecharacterizationoftheneutralizingbovineviraldiarrheavirusmonoclonalantibodiesandantigenicdiversityofE2glycoprotein[J]．JVetMedSci，2012，4(9)：1117-1120．）。E2蛋白对病毒RNA的装配或病毒粒子的组装、病毒与受体或感染的细胞之间的互相作用非常重要。由于BVDV存在不同的生物型、不同的基因型且不同的毒株上毒力差异很大，多数弱毒或无毒的BVDVII型毒株都可能对牛产生持续性的感染，目前传统的BVDV疫苗只包括了BVDVⅠ型，如CN105949286A就公开了一种单独表达了Ⅰ型BVDVE2蛋白的方法。而且，研究表明，BVDVⅠ型与BVDVⅡ型E2蛋白核苷酸同源性在60％以下，氨基酸同源性低于65％，BVDVⅡ型E2蛋白还存在两个氨基酸残基的缺失，这一缺失导致BVDVⅡ型与BVDVⅠ型有不同的抗原表位，说明BVDVⅠ型疫苗对BVDVII的感染没有有效的保护作用。CN107823639A公布了一种由BVDVIa、BVDVIb、BVDVIIa、BVDVIIb四种基因亚型灭活抗原制备的全病毒灭活疫苗，其制备抗原过程繁琐，成本较高，且灭活疫苗虽然安全程度较高，但仍然存在滴度低，散毒风险高，与流行毒株匹配度不高等问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗、其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。为实现前述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的制备方法，其特征在于包括：/n克隆包含重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白编码基因的真核表达载体；/n以所述真核表达载体转染CHO细胞，并筛选获得能够悬浮稳定高效表达所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的CHO细胞株，之后发酵培养所述CHO细胞株，再分离获得所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白；/n所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的制备方法，其特征在于包括：
克隆包含重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白编码基因的真核表达载体；
以所述真核表达载体转染CHO细胞，并筛选获得能够悬浮稳定高效表达所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的CHO细胞株，之后发酵培养所述CHO细胞株，再分离获得所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白；
所述融合蛋白的序列如SEQIDNO:2所示。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述真核表达载体包括pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述真核表达载体为pCI-GS。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述CHO细胞包括DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述CHO细胞为CHO-S细胞株。


6.一种免疫组合物的制备方法，其特征在于包括：
采用权利要求1-5中任一项所述的方法制备重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白；
将所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白与佐剂充分混合。


7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文龙，孔迪，滕小锘，易小萍，张大鹤，
申请(专利权)人：苏州世诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32