蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法技术

本发明专利技术公开了一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法。蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因为黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝或者园蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元以1‑8倍连续重复构成的基因序列，具有改良家蚕丝性能等应用；先构建家蚕合成分泌葡萄状腺丝蛋白的载体pBac‑ACSP质粒，将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用转座子使荧光蛋白基因和葡萄状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕。本发明专利技术发现了一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因的用途，并开发了一种新型家蚕蜘蛛仿生丝的改良家蚕丝性能的生产方法，降低生产成本，显著提高了蚕丝的机械性能。

【技术实现步骤摘要】
蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法
本专利技术涉及了一种基因的应用及其作用方法，尤其是涉及了一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因(ACSP)改良家蚕丝性能的方法。
技术介绍
具有庞大家族的蜘蛛属于节肢动物门(Arthropoda)，蛛形纲(Arachnida)，蜘蛛目，目前已知含有112个科，3095个属，大概共有4万4千多种。大多数蜘蛛都能产生蜘蛛丝，例如雌性的织网蜘蛛(orb-weavers)可以产生七种不同类型的蜘蛛丝，包括大囊状腺丝(MajorAmpullateSilk)，小囊状腺丝(MinorAmpullateSilk)，鞭毛状腺丝(FlagelliformSilk)，管状腺丝(Tubuliformsilk)，梨状腺丝(Pyriformgland)，葡萄状腺丝(AciniformSilk)等，每种丝都由不同的丝腺分泌，不同类型的蜘蛛丝具有各自的功能，共同搭建蜘蛛赖以生存和繁殖的蜘蛛网。蜘蛛丝纤维因出色的机械性能而闻名,它兼具稳定性、柔韧性、高强度和高延展性。蜘蛛的葡萄状腺丝(AciniformSilk，AcSp)具有多种功能，如在蜘蛛卵壳内形成柔软的衬里，是包裹猎物的坚实外壳和梨状腺丝的附着物。葡萄状腺丝蛋白约300kDa，包含(GGX)n结构域。黑寡妇蜘蛛(Latrodectushesperus)完整的葡萄状腺丝(AcSp1)基因序列长39269bp，外显子为18999bp，被收录于基因库JX978171.1。与其他蜘蛛丝蛋白一样，黑寡妇蜘蛛的葡萄状腺丝AcSp1由非重复的N末端、C末端和16倍重复单元构成的核心序列组成，且重复单元以丝氨酸(S)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)为主。园蛛完整的AcSp基因序列长为10387bp，由非重复的N末端、C末端和15倍重复单元构成的核心序列组成，且前14个重复单元的长度均为203个氨基酸，而最后一个重复单元的长度为197个氨基酸，被收录于基因库MG021196.1。AcSp1蛋白重复区域约占整个蛋白质的88％，而且在重复区域中最丰富的三个氨基酸(甘氨酸，丙氨酸和丝氨酸)占总数的45％。蜘蛛丝具有生物相容性、生物可降解性以及卓越的机械性能，其卓越性能是合成纤维和家蚕丝等无法超越的。但是，令人遗憾的是，由于蜘蛛的领土意识和自相残杀的本能，它们吐的丝就不可能大规模地生产。因此，蜘蛛丝蛋白的实际的应用市场就无法实现。越来越多的科学家就尝试利用分子生物学技术去制造转基因蜘蛛丝，已经在酵母菌，细菌,哺乳动物细胞,转基因植物和昆虫细胞等不同宿主中表达了蜘蛛丝蛋白。在这些生物中虽然都表达了蛋白，但是没有一个具备自然纺丝的能力，即异源蛋白生产系统无法将蜘蛛丝蛋白组装成丝纤维。另外，在这些宿主生物中还存在转基因表达产率低和溶解度低等问题。由于家蚕具有生长周期短、繁殖率高、个体中等、易被大批量驯养等优点，更重要的是它本身就可以大量生产蚕丝。因此，研究者便尝试用家蚕作为大量生产蜘蛛丝的生物反应器。家蚕和蜘蛛都是能够生产丝蛋白的动物，而蜘蛛丝的弹性与韧性更好，但是蜘蛛丝本身不仅产丝量低而且具有侵略性，难以大批量驯养，因此利用家蚕作为生物反应器来表达蜘蛛丝，可以获得超天然的复合纤维丝。但已有的研究主要是针对大壶状腺丝蛋白方面。2010年，Wen等基于piggyBac转座系统使得Ser1启动子驱动的蜘蛛大壶状腺丝(MaSp1)在家蚕的中部丝腺成功表达，而且重组蜘蛛丝的机械性能提升了15.3％。2012年，Teulé等利用piggyBac介导的转基因技术在家蚕后部丝腺成功表达了重链Fib-H启动子启动的蜘蛛丝蛋白A2S814，Westernblot证实它的确存在蚕茧中，蚕丝的机械性能也得到了很大改善。2014年，Kuwana等利用piggyBac转座系统插入了蜘蛛(Araneusventricosus)MaSp1基因，获得的转基因家蚕表达了重链蛋白和蜘蛛牵引丝蛋白(MaSp1)的融合蛋白，尽管MaSp1的含量仅为天然重链蛋白的0.37-0.61％(w/w)，但是复合纤维丝的韧性相对于野生型家蚕提高了53％左右，而且他们的转基因蚕丝从蚕茧加工成了纺织品。现有技术中缺少了针对其他蜘蛛丝蛋白基因提高蚕丝性能的有效的转基因处理方法和有效作用基因的发现，而本专利技术发现了葡萄状腺丝蛋白基因具有显著提高蚕丝性能的作用。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于利用转基因家蚕技术将葡萄状腺丝基因(AcSp)导入家蚕基因组内，并在家蚕后部丝腺细胞中特异性表达，提供一种利用家蚕后部丝腺细胞合成分泌葡萄状腺丝蛋白的方法，开发出能合成分泌葡萄状腺丝蛋白的家蚕，通过家蚕丝腺细胞分泌的葡萄状腺丝蛋白可以在茧层中检测到，且很大程度上提高了蚕丝的机械性能，为开发具有更优异机械性能的蚕丝奠定基础。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案的步骤如下：一、一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用：所述蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因的碱基为黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列或者园蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元如SEQIDNO.1，黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元是从完整的黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因碱基序列中局部人工提取获得。园蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元如SEQIDNO.2，园蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元是从完整的园蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因碱基序列中局部人工提取获得。所述改良家蚕丝性能是提高蚕丝机械性能。二、一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法：该方法是构建改良家蚕丝力学性能的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因的表达框，表达框组成包含家蚕丝蛋白信号肽、蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因和丝蛋白polyA；然后构建带有表达框的质粒，然后将质粒导入到家蚕基因组中经多次培养续代培育成荧光基因和蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕，获得能够高效率大规模生产蜘蛛葡萄状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系；所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因采用权利要求1所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因。所述的方法具体如下：(1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌葡萄状腺丝蛋白的质粒pBac-ACSP，质粒pBac-ACSP包含有作为外源基因的葡萄状腺丝蛋白(ACSP)和标记基因荧光蛋白的基因；(2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBac-ACSP质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1-2：1的比例导入家蚕产卵后2-8小时内的受精卵中，利用piggyBac转座子将葡萄状腺丝蛋白插入到家蚕基因组内；(3)蚕卵孵化后再经多次培养续代育成荧光基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：/n所述蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因的碱基为黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列或者园蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：
所述蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因的碱基为黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列或者园蛛葡萄状腺丝(ACSP)基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。


2.根据权利要求1所述的一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：所述改良家蚕丝性能是提高蚕丝机械性能。


3.一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：
该方法是构建改良家蚕丝力学性能的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因的表达框，表达框组成包含家蚕丝蛋白信号肽、蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因和丝蛋白polyA；然后构建带有表达框的质粒，然后将质粒导入到家蚕基因组中经多次培养续代培育成荧光基因和蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕，获得能够生产蜘蛛葡萄状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系；所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因采用权利要求1所述的蜘蛛葡萄状腺丝蛋白(ACSP)基因。


4.根据权利要求3所述的一种利用蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的方法具体如下：
(1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌葡萄状腺丝蛋白的质粒pBac-ACSP，质粒pBac-ACSP包含有作为外源基因的葡萄状腺丝蛋白(ACSP)和标记基因荧光蛋白的基因；
(2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBac-ACSP质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1-2：1的比例导入家蚕产卵后2-8小时内的受精卵中，利用piggyBac转座...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟伯雄，王晓晓，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33