一种高表达层粘连蛋白-511变体的方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物领域，具体涉及一种高表达层粘连蛋白‑511变体的方法及其应用。首先公开了一种表达载体pPBmL‑CCP‑TPA，其以PiggyBac转座子质粒为骨架，调控单元包括：CCP启动子和TPA信号肽基因。还公开了利用该表达载体pPBmL‑CCP‑TPA构建表达LM511E8F的细胞株的方法。本发明专利技术构建了一种含有细胞表达强启动子和分泌信号肽的质粒，通过筛选获得高效、稳定表达LM511E8F的细胞株，同时优化下游制备工艺，从而实现LAM511E8F重组蛋白的量产。

【技术实现步骤摘要】
一种高表达层粘连蛋白-511变体的方法及其应用
本专利技术属于生物领域，具体涉及一种高表达层粘连蛋白-511变体的方法及其应用。
技术介绍
人多能干细胞(hPSC)，包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞(hiPSC)，是一种具有无限扩增以及多向分化潜能的细胞，在再生医学领域有着广泛的应用前景。hPSC培养体系的演变包括了培养基和胞外基质的发展。其中胞外基质为hPSC的粘附、增殖和分化提供重要支持。胞外基质大体经过三个阶段的发展，从第一阶段的饲养层细胞，如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)到第二阶段基质胶(Matrigel)，再到第三阶段的基质蛋白，从成分复杂到成分明确，从而为临床级hPSC与细胞制剂的生产奠定了基础。MEF作为饲养层细胞可以支持hPSC的贴壁和扩增。但MEF在使用时有明显劣势：1)在制备时需要准备12.5-14.5d的怀孕小鼠，来源受限、制作耗时、质量不均一且成本昂贵；2)生命周期短，体外分裂20次左右就衰老，其产生促增殖因子和抑制分化因子的能力逐渐减弱甚至消失；3)鼠源性饲养层细胞会带来动物来源病原体和异种抗原污染，不能应用于临床级hPSC及其衍生细胞产品的生产；4)MEF不具有耐药性，不能作为基质用于筛选转染外源性基因的干细胞。Matrigel是目前常用培养hPSC的基质。Matrigel来源于EHS小鼠肉瘤，主要成分包括层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、巢蛋白、纤维原蛋白生长因子、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂和其他生长因子。Matrigel基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成和功能。Matrigel基底膜基质形成的三维培养基质，可以促进hPSC的贴壁和扩增。与MEF相比，Matrigel无需繁琐的小鼠饲养层的维护，可以兼容多种hPSC细胞系；同时，无饲养层系统，可减少来自饲养层细胞污染的可能性；可以用于相关代谢或毒理学研究。但Matrigel在实际应用时有一定的缺点：1)来源于富含胞外基质的EHS小鼠肿瘤，存在动物来源病原体和异种抗原污染的风险,不能应用于临床级hPSC及其衍生细胞产品的生产；2)成分复杂，含有多种不明确成分，批次间差异较大。基质蛋白是一类可以支持细胞贴壁、增殖及分化的蛋白质及其衍生物的总称。目前已有多种基质蛋白能支持hPSC在成分完全明确的培养基中贴壁和扩增，主要包括层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白等。这些基质蛋白可以从人源组织(如血浆)中提纯获取，也可通过分子生物学技术，利用宿主细胞进行重组表达和纯化。与MEF和Matrigel相比，基质蛋白具有明显优势：1)成分明确、无动物源成分；2)可以通过重组蛋白表达技术规模化生产，并且可以进行明确定量和相关质量控制，使得不同批次的基质蛋白质量稳定、可重复性高。3)操作简单、省时，大大简化了hPSC的培养与分化。层粘连蛋白(laminin，LM)是基底膜的主要成分，可以支持多种细胞的生长。LM最初是由RuperTimpl等于70年代末从小鼠EHS肉瘤中分离的非胶原性糖蛋白。用纯化的LM抗体，通过间接免疫荧光法检测，发现除EHS肉瘤外，LM还广泛分布于多种动物及人类细胞基底膜基质中，主要位于透明层。LM是基膜(basallamina)所特有的非胶原糖蛋白，是有三个亚基α、β和γ链组装成十字型的异源三聚体,相对分子质量为820kDa，含13-15％的糖，其中一条重链(α链，400kDa)，两条轻链(β链，215kDa；γ链，205kDa)，三条链在结构上呈现不对称的十字形，由一条长臂和三条相似的断臂构成。β和γ断臂上各有两个球形结构域，α链上的断臂有三个球形结构域，其中第一个结构域同Ⅳ型胶原结合，第二个结构域同肝素结合，还有同细胞表面受体结合的结构域。LM通过这些独立的结合位点介导细胞与基底膜的结合。LM在细胞发育过程中能够刺激细胞粘附、伸展，能够刺激胚胎中神经轴的生长，促进成年动物的神经损伤后的重生长和再生。作为一种细胞培养基质，LM能够影响细胞的粘附、迁移、增殖和分化。人基因组中LM包含5个α链(α1-α5)，4个β链(β1-β4)和3个γ链(γ1-γ3)，目前已确定最少有15种由不同亚基组装成的不同LM亚型。LM亚型在不同组织类型和发育阶段的表达模式不同，发挥不同的功能。现已证明LM及其不同的亚型在hPSC的培养和分化方面具有明显优势，如LM511(α5β1γ1)。LM511可以结合hPSC细胞表面受体(如整合素α6β1)，从而促进hPSC的贴壁和扩增。但组织来源的LM511非常昂贵，哺乳动物细胞蛋白表达提纯LM511重组蛋白产量也非常低，不利于hPSC的常规培养。后续研究表明由α5、β1、γ1羧基端(C端)截断体组成的LM511-E8，与野生型LM511一样能支持hPSC的贴壁和扩增。此外，在LM511-E8的γ1侧链螯合纤维粘连蛋白(Fibronectin，FN)FNⅢ7-10(Pro1173-Arg1539)结构域后的LM511E8F(高表达层粘连蛋白-511变体)可以进一步增加iPSC贴壁效率，促进iPSC增殖。但目前有报道关于制备重组LM511E8F的效率比较低，主要表现为产量低、后续处理繁琐。
技术实现思路
本专利技术旨在构建一种含有细胞表达强启动子和分泌信号肽的质粒，通过筛选获得高效、稳定表达LM511E8F的细胞株，同时优化下游制备工艺，从而实现LAM511E8F重组蛋白的量产。具体的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术第一个方面公开了一种表达载体pPBmL-CCP-TPA，以PiggyBac转座子质粒为骨架，调控单元包括：CCP启动子和TPA信号肽基因；所述CCP启动子具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列或其变体序列；所述TPA信号肽基因具有如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列或其变体序列。在本专利技术中，采用的是“CCP启动子”，该启动子是人工构建的强组合启动子，由人巨细胞病毒即刻早期增强子、人巨细胞病毒即刻早期启动子、HTLVLTR重复区域(以提高蛋白翻译效率)、合成兔β-球蛋白3端内含子等组成，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平和持续表达。该启动子在多种细胞中被验证能够以远超CMV启动子的效率启动下游基因的表达。CCP启动子能够长时程表达，能够在多种细胞类型中驱动基因表达而不被沉默。此外，与CCP启动子具有相似功能与活性的启动子也可以用于本专利技术，并没有超出本专利技术的保护范围。通过对原有的表达载体PiggyBac转座子质粒进行优化，用嵌合CCP启动子替代原有的EF1a启动子，提高外源基因在293F细胞中的转录与翻译水平，增加蛋白表达量。CCP启动子序列具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列或及其变体系列。该变体序列与SEQIDNO：1具有至少85％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。所述的差异由碱基的取代、缺失或添加所致。同时本专利技术中，将人组织型纤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达载体pPBmL-CCP-TPA，其特征在于，以载体PiggyBac转座子质粒为骨架，调控单元包括：CCP启动子和TPA信号肽基因；/n所述CCP启动子具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其变体序列；/n所述TPA信号肽基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或其变体序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达载体pPBmL-CCP-TPA，其特征在于，以载体PiggyBac转座子质粒为骨架，调控单元包括：CCP启动子和TPA信号肽基因；
所述CCP启动子具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列或其变体序列；
所述TPA信号肽基因具有如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列或其变体序列。


2.一种构建权利要求1所述表达载体pPBmL-CCP-TPA的方法，其特征在于，所述表达载体pPBmL-CCP-TPA由PiggyBac转座子质粒骨架、CCP启动子和TPA信号肽基因通过酶切连接重组获得。


3.一种表达LM511E8F的细胞株，其特征在于，所述细胞株的构建方法包括：
S1：将基因α5E8、β1E8和FNIII-γ1E8分别转入权利要求1所述的表达载体pPBmL-CCP-TPA中，分别得到重组质粒pPBmL-CCP-TPA-α5E8(NeoR+)、pPBmL-CCP-TPA-β1E8(HygR+)和pPBmL-CCPTPA-FNIII-γ1E8(PuroR+)；
S2：将重组质粒pPBmL-CCP-TPA-α5E8(NeoR+)、pPBmL-CCP-TPA-β1E8(HygR+)和pPBmL-CCP-TPA-FNIII-γ1E8(PuroR+)共同转入HEK293细胞中，经过筛选获得阳性细胞群，即得到表达LM511E8F的细胞株。


4.根据权利要求3所述的表达LM511E8F的细胞株，其特征在于，在S2之后还包括S3：将得到的阳性细胞群接种于多孔板中，待细胞汇合度为80-90％时，取上清液进行蛋白质定量检测，筛选得到高表达LM511E8F的细胞株。


5.根据权利要求3-4任一项所述的细胞株生产得到的LM511E8F重组蛋白。


6.一种LM511E8F重组蛋白，由以下三种多肽组装而成：
α5E8，或包含与α5E8有至少80％同源性的多肽；
β1E8，或包含与β1E8有至少75％同源性的多肽；
FNIII-γ1E8，或包含与FNIII-γ1E8有至少75％同源性的多肽；
优选的，其中在α5E8、β1E8和FNIII-γ1E8序列的氨基端分别连入标签蛋白抗体。

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：安徽中盛溯源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34