猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法技术

本发明专利技术公开了一种猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法：分别构建重组质粒pCMV‑N‑HA‑caspase‑1、重组质粒p3×Flag‑N‑GSDMD‑FL、重组质粒p3×Flag‑C‑GSDMD‑FL；将重组质粒pCMV‑N‑HA‑caspase‑1分别与重组质粒p3×Flag‑N‑GSDMD‑FL、重组质粒p3×Flag‑C‑GSDMD‑FL共转染至HEK293T细胞内，经培养，得两种由猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型。本发明专利技术为后续猪GSDMD蛋白的生物学功能研究奠定基础，并为相关猪病的治疗提供建议。

【技术实现步骤摘要】
猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型的建立方法。
技术介绍
细胞焦亡(Pyroptosis)是2018年最新定义的一种程序性细胞死亡方式，由Gasdermin家族蛋白(主要是GasderminD，GSDMD)介导，以细胞膜孔形成、细胞肿胀、破裂为特征。2002年，Tschopp在MolCell发文首次提出了炎症小体(Inflammasome)的概念，它可以特异性切割pro-caspase-1产生活化的caspase-1，caspase-1继而切割并活化IL-1β和IL-18等细胞因子导致细胞焦亡的发生。后续研究发现不同类型的炎症小体均可以特异性激活caspase-1，因此炎症小体一度被认为是执行细胞焦亡的直接途径。直到2015年，同期发表于Nature的两篇文章都证明了GSDMD蛋白才是炎性caspase的直接底物，是细胞焦亡的真正执行者。后续研究证明，经典的炎症小体可以识别不同的病原，导致自身激活和caspase-1的活化，活化的caspase-1一方面可以切割pro-IL-1β，另一方面可以切割GSDMD产生N端结构域进而在细胞膜上打孔，导致细胞焦亡。非经典途径时，小鼠pro-caspase-11(人pro-caspase-4/5)可以直接识别并结合革兰氏阴性菌的LPS导致caspase-11的活化，活化后的caspase-11直接切割GSDMD，导致细胞膜孔洞的形成并引发焦亡。病毒感染宿主细胞后，细胞焦亡并不利于病毒在细胞内的增殖。已有研究证明，病毒为逃避宿主的抵抗而进化出了不同策略来抑制NLRP3炎症小体的激活以及GSDMD介导的细胞焦亡，如肠道病毒EV71(Enterovirus71)感染宿主细胞后，为了保持细胞的完整性，EV71的非结构蛋白2A和3C可以切割NLRP3蛋白导致其失活从而抑制细胞焦亡；此外，EV71的3C蛋白也可以直接在193位氨基酸后异位切割GSDMD导致其失活，使其不能在细胞膜上打孔引起细胞焦亡。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型的构建方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法，包括以下步骤：1)、构建重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1、重组质粒p3×Flag-N-GSDMD-FL、重组质粒p3×Flag-C-GSDMD-FL；2)、将重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1分别与重组质粒p3×Flag-N-GSDMD-FL、重组质粒p3×Flag-C-GSDMD-FL共转染至HEK293T细胞内，经培养，即得两种由猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型。作为本专利技术的猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型的构建方法的改进：将重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1分别与重组质粒p3×Flag-N-GSDMD-FL、重组质粒p3×Flag-C-GSDMD-FL共转染至HEK293T细胞内，转染剂量分别为pCMV-N-HA-caspase-1：600ng、p3×Flag-N-GSDMD-FL：600ng、p3×Flag-C-GSDMD-FL：600ng；于37℃、5％CO2培养箱内培养，培养时间为24-30小时，即可得两种猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型。作为本专利技术的猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型的构建方法的进一步改进：以经LPS刺激的猪肺泡巨噬细胞cDNA为模板，PCR扩增pro-caspase-1、GSDMD基因的相应片段，经酶切后与相应空载连接，pro-caspase-1连接入pCMV-N-HA空载，GSDMD分别连接入p3×Flag-CMV-7.1空载(标签位于N端)和p3×Flag-CMV-14空载(标签位于C端)，从而构建重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1、重组质粒p3×Flag-N-GSDMD-FL、重组质粒p3×Flag-C-GSDMD-FL。作为本专利技术的猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型的构建方法的进一步改进：PCR扩增相应目的片段所使用的引物分别为：pCMV-N-HA-caspase-1：上游：5'-ggaggcccgaattcggtcgaccatggccgataaggtgctga-3'下游：5'-catgtctggatccccgcggccgcttaatgtcctgggaagagataaaaag-3'p3×Flag-N-GSDMD-FL：上游：5'-ccggaattctatggcatcagcctttgag-3'下游：5'-ctagtctagactagcagagctggctgagc-3'p3×Flag-C-GSDMD-FL：上游：5'-ccggaattcatggcatcagcctttgag-3'下游：5'-ctagtctagagcagagctggctgag-3'本专利技术的猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型的构建方法，具体包括以下步骤：1)、真核表达质粒的构建：以经LPS刺激的猪肺泡巨噬细胞cDNA为模板，PCR扩增pro-caspase-1、GSDMD基因的相应片段，经酶切后与相应空载连接，pro-caspase-1连接入pCMV-N-HA空载，GSDMD分别连接入p3×Flag-CMV-7.1空载(标签位于N端)和p3×Flag-CMV-14空载(标签位于C端)，连接产物转化入感受态细胞中涂板培养；待菌落长出后挑取单菌落进行摇菌培养并提取质粒进行酶切及测序，验证重组质粒是否构建成功；2)、重组质粒表达验证：将酶切及测序验证无误的三个重组质粒分别转染至HEK293T细胞内，收取细胞蛋白并用Westernblot方法验证各蛋白的表达情况；重组质粒表达验证所用转染量分别为：pCMV-N-HA-caspase-1：2000ng、p3×Flag-N-GSDMD-FL：2000ng、p3×Flag-C-GSDMD-FL：2000ng。3)、重组质粒共转染：调整各质粒的转染浓度，按优化后的转染浓度将重组质粒共转染至HEK293T细胞内，收集细胞培养上清液，检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量；收集细胞，使用碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)对细胞进行染色，使用流式细胞仪对细胞染色情况进行检测，进而反应细胞焦亡的程度。进一步的具体步骤如下：(1)真核表达质粒的构建：以经LPS刺激的猪肺泡巨噬细胞cDNA为模板，PCR扩增pro-caspase-1、GSDMD基因的相应片段。其中，PCR所用的引物分别为：pCMV-N-HA-caspase-1：上游：5'-ggaggcccgaattcggtcgaccatggccgataaggtgctga-3'下游：5'-catgtctggatccccgcggccgcttaatgtcctgggaagagataaaaag-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法，其特征是包括以下步骤：/n1)、分别构建重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1、重组质粒p3×Flag-N-GSDMD-FL、重组质粒p3×Flag-C-GSDMD-FL；/n2)、将重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1分别与重组质粒p3×Flag-N-GSDMD-FL、重组质粒p3×Flag-C-GSDMD-FL共转染至HEK293T细胞内，经培养，得两种由猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型。/n

【技术特征摘要】
1.猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法，其特征是包括以下步骤：
1)、分别构建重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1、重组质粒p3×Flag-N-GSDMD-FL、重组质粒p3×Flag-C-GSDMD-FL；
2)、将重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1分别与重组质粒p3×Flag-N-GSDMD-FL、重组质粒p3×Flag-C-GSDMD-FL共转染至HEK293T细胞内，经培养，得两种由猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型。


2.根据权利要求1所述的猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法，其特征是所述步骤2)为：
将重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1分别与重组质粒p3×Flag-N-GSDMD-FL、重组质粒p3×Flag-C-GSDMD-FL共转染至HEK293T细胞内，转染剂量分别为pCMV-N-HA-caspase-1：600ng、p3×Flag-N-GSDMD-FL：600ng、p3×Flag-C-GSDMD-FL：600ng；于37℃、5％CO2培养箱内培养，培养时间为24～30小时，得两种猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型。


3.根据权利要求1或2所述的猪GSDMD蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法，其特征是所述步骤1)为：
以经LPS刺激的猪肺泡巨噬细胞cDNA为模板，PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：师福山，吕倩，李肖梁，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33