具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法技术方案

本发明专利技术提供一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：具有人工补充外源性细胞因子IL‑15的步骤。本发明专利技术在补充外源性的人源细胞因子后，人源化免疫系统小鼠体内的NK细胞发育水平得到了极大提高，达到了正常人外周血中相应NK细胞亚群的水平，且具备相应的功能。

【技术实现步骤摘要】
具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法
本专利技术涉及一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，属于生物模型领域。
技术介绍
人类的免疫应答需要在体内进行，由于受到伦理限制，不能直接以人为实验对象。啮齿类动物是广泛应用于实验研究的小动物模型，目前免疫系统发育分化及功能研究大多来源于这些模型，但是因为种属特异性的存在，啮齿类动物模型得到的结论并不能直接推导于人类免疫系统。人类的造血免疫功能研究、感染类疾病、自身免疫病以及肿瘤研究都难以实现体内动态观察。一些研究人员则以灵长类动物为替代对象，试图弥补人类与啮齿类动物之间巨大的种属差异，但是因实验对象操作复杂，经济成本高，并不利于推广。黑猩猩、长臂猿等灵长类动物虽然能感染HIV，但是感染后并不发病，而且属濒危动物，逐渐被禁止使用。因此，亟需一种能够应用于人类免疫应答的小动物模型，免疫系统人源化小鼠便应运而生。免疫系统人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠植入人的造血细胞、淋巴细胞或组织而具有人的免疫功能的小鼠模型，为了解人类免疫系统及其免疫应答的重要工具。由于普通小鼠中存在的免疫细胞会排斥外来移植的人源造血干细胞或淋巴细胞，为了制作免疫系统人源化的小鼠，需要拥有有足够免疫缺陷程度的小鼠。早在1988年，Mccune等发现在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中植入人胎肝干细胞、胎胸腺和胎淋巴结可以支撑人源T细胞和B细胞的重建。但是由于SCID小鼠较强的NK细胞功能对外源细胞的排斥作用，及随年龄增长出现小鼠T、B细胞，即发生“渗漏现象”等因素，均极大程度的限制了重建。随后通过SCID缺陷小鼠与NOD背景小鼠回交，产生了NOD/SCID小鼠，该小鼠NK细胞活性及天然免疫细胞的功能更低，可以更好地支持重建，所以在接下来的很长一段时间里，NOD/SCID小鼠被认为是用于人源化重建的最理想受者小鼠。然而，当研究者用造血干细胞进行免疫重建时，残存的NK细胞和天然免疫细胞活性，仍然成为了难以跨越的障碍。因此，为了制作更加完善的人源化免疫系统小鼠，需要克服目前免疫缺陷动物中过强的NK细胞功能。而NK细胞发育成熟过程中，IL-2是起到主要作用的细胞因子。因此，对NOD/SCID小鼠的IL-2受体的gamma亚基进行敲除，其体内的T，B和NK细胞基本完全缺失或失去功能，巨噬细胞及DC细胞及补体系统的功能也大幅减弱，且成年后不再会发生免疫渗漏问题，使其成为目前免疫缺陷程度最高的小鼠。且此重度免疫缺陷小鼠寿命比普通NOD/SCID小鼠长30-50％，达1.5-2年，极大的延长了实验的观察期。以上优点，使得此重度免疫缺陷小鼠对人源组织几乎没有排斥反应，使其成为目前最适合作为人源组织/细胞移植的实验动物，包括人源化动物模型(CD34+，BLT及PBLS人源化小鼠)，肿瘤移植及肿瘤干细胞研究(CDX，PDX)，人造血和免疫系统研究和人类感染性疾病(HIV，HBV)的动物模型首选。但是上述小鼠的髓系免疫系统仍然保持完好。而且由于其淋巴系免疫系统的重度缺陷，其髓系免疫系统进行了代偿，使得其髓系免疫系统比普通小鼠更为强大。并且由于NK细胞的发育需要特定细胞因子的诱导分化和支持，例如IL-2和IL-15等细胞因子。而这些细胞因子的人鼠同源性较差，人的造血干细胞上的细胞因子受体，无法与鼠源的细胞因子结合。使得上述小鼠接种人源造血干细胞后，由于NK细胞的增殖能力较差，且面临来自小鼠髓系免疫系统的异体的排斥和吞噬作用等原因，其体内很难有NK细胞发育出来。进一步加大了人NK细胞发育的困难程度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，进一步完善人源化免疫系统小鼠，使其具有更加完整的免疫系统。本专利技术采用了如下技术方案：一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：具有人工补充外源性细胞因子IL-15的步骤。进一步，本专利技术的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：补充细胞因子IL-15的方法包括AAV载体、质粒的高压水动力注射、FC化的长效细胞因子注射或者普通细胞因子注射。进一步，本专利技术的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，包括：步骤一：制作常规的人源化免疫系统小鼠；步骤二：制备包装好的AAV载体，AAV载体中包含细胞因子IL-15基因；步骤三：向常规的人源化免疫系统小鼠体内注射包装好的AAV载体。进一步，本专利技术的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：步骤一中，制作常规的人源化免疫系统小鼠的方法如下：步骤1-1，选用新生小鼠，进行全身辐照清髓。射线的剂量为0.5-3Gy每只小鼠；步骤1-2，经辐照处理后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1*104～1*106每只小鼠；步骤1-3，干细胞接种8周后，对该人源化免疫系统小鼠的外周血中人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过15％，即能够用于新一代人源化免疫系统小鼠的构建。进一步，本专利技术的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：步骤二中制备AAV载体的步骤如下：步骤2-1，根据IL-15的人源基因序列进行引物设计；步骤2-2，扩增目的基因IL-15；步骤2-3，将目的基因构建入线性化表达载体中，形成重组质粒；步骤2-4，制备感受态细胞；步骤2-5，将重组后的质粒转化到感受态细胞中；步骤2-6，使用菌落PCR鉴定阳性转化子；步骤2-7，提取构建成功的质粒；步骤2-8，将质粒包装到AAV病毒载体中。进一步，本专利技术的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：步骤三中，尾静脉注射包装好的AAV病毒载体，剂量范围为1*109～2*1011每只小鼠。进一步，本专利技术的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：AAV病毒包装完成后，还具有AAV对293T细胞的表达验证的步骤：步骤2-10：总蛋白抽提：将病毒与293T细胞共同培养48小时后，离心洗涤并分离细胞，将细胞裂解后提取总蛋白，步骤2-11：测蛋白浓度，步骤2-12：样品制备，步骤2-13：SDS-PAGE凝胶电泳，步骤2-14：转膜，步骤2-14：免疫反应，成像仪拍照。进一步，本专利技术的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：Fc化细胞因子注射的方法如下：制备Fc化细胞因子：步骤4-1，IL-15功能基因的克隆；步骤4-2，人IgGFc基因的克隆；步骤4-3，Fc融合蛋白表达质粒的构建；步骤4-4，将表达质粒转入受体细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：/n具有人工补充外源性细胞因子IL-15的步骤。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：
具有人工补充外源性细胞因子IL-15的步骤。


2.如权利要求1所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：
补充细胞因子IL-15的方法包括AAV载体、质粒的高压水动力注射、FC化的长效细胞因子注射或者普通细胞因子注射。


3.如权利要求1所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：
步骤一：制作常规的人源化免疫系统小鼠；
步骤二：制备包装好的AAV载体，AAV载体中包含细胞因子IL-15基因；
步骤三：向常规的人源化免疫系统小鼠体内注射包装好的AAV载体。


4.如权利要求3所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：
步骤一中，制作常规的人源化免疫系统小鼠的方法如下：
步骤1-1，选用新生小鼠，进行全身辐照清髓。射线的剂量为0.5-3Gy每只小鼠；
步骤1-2，经辐照处理后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1*104～1*106每只小鼠；
步骤1-3，干细胞接种8周后，对该人源化免疫系统小鼠的外周血中人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过15％，即能够用于新一代人源化免疫系统小鼠的构建。


5.如权利要求3所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：
步骤二中制备AAV载体的步骤如下：
步骤2-1，根据IL-15的人源基因序列进行引物设计；
步骤2-2，扩增目的基因IL-15；
步骤2-3，将目的基因构建入线性化表达载体中，形成重组质粒；
步骤2-4，制备感受态细胞；
步骤2-5，将重组后的质粒转化到感受态细胞中；
步骤2-6，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨楠，陈洁，傅秋华，罗艳，段继峰，
申请(专利权)人：澎立生物医药技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31