本发明专利技术涉及一种基于重组腺相关病毒8型的microRNA‑212‑3P海绵的构建及其应用。本发明专利技术明确了下调肝脏miR‑212‑3P的表达可降低肝脏脂质积累，预防高脂饮食所致的非酒精性脂肪性肝病；构建了一种microRNA‑212‑3P海绵，基于rAAV8载体递送该microRNA‑212‑3P海绵，这种基因疗法被证实其对肝脏脂质积累、血清脂质含量的降低作用显著，取得良好的实验性NAFLD防治效果。本发明专利技术为非酒精性脂肪性肝病的基因治疗提供了新的工具。
【技术实现步骤摘要】
一种基于重组腺相关病毒8型的microRNA-212-3P海绵的构建及其应用
本专利技术涉及生物医药
，具体地说，涉及一种基于重组腺相关病毒8型的microRNA-212-3P海绵的构建及其应用。
技术介绍
非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD)通常始于单纯脂肪变性，其特征是甘油三酸酯(TG)积聚在肝细胞脂质滴内，进而可发展为非酒精性脂肪性肝炎，肝硬化，甚至是肝细胞癌。有效防治NAFLD对改善人们生活质量及疾病预后有重要意义。目前临床上尚无针对NAFLD的特效防治药物，生活方式干预仍是NAFLD首选的防治手段，包括健康饮食及运动。临床研究显示运动能有效防止NAFLD的发生与发展。然而临床上却存在相当部分病人因生活习惯或疾病不能坚持或耐受运动，导致NAFLD控制不良而进展至肝衰竭甚至肝癌。寻找运动治疗NAFLD的作用靶点，有助于发掘新的治疗NAFLD的方法和策略(如研发调控相关靶点的药物或工具)，在NAFLD病人，特别是不能耐受运动治疗的病人中可模拟运动达到治疗目的，将对改善患者预后具有良好的临床价值和积极的社会意义。微小RNA(MicroRNA，miRNA，miR)在NAFLD发生中的作用正日益受到重视。已有研究表明微小RNA参与NAFLD，但是否参与介导运动对NAFLD的保护尚待阐明。我们前期的研究(XiaoJ,BeiY,LiuJ,etal.miR-212downregulationcontributestotheprotectiveeffectofexerciseagainstnon-alcoholicfattyliverviatargetingFGF-21.JCellMolMed.2016Feb；20(2):204-16)显示：运动改善小鼠NAFLD伴随miR-212下调；细胞水平过表达miR-212可导致肝细胞脂质沉积，抑制miR-212具有反向作用，机制研究发现该过程由其靶基因FGF-21介导。而由于前期研究仅局限于体外细胞层面发现miR-212与肝细胞脂质沉积的关系，且miR-212与肝脏疾病的具体关系目前并不明朗，例如文献(孙飞.血清miR-132和miR-212检测在肝硬化诊断中的应用价值.《临床医药文献电子杂志》.2016,3(28):5689-5690)公开了临床肝硬化患者血清miR-212表达明显低于健康对照，差异有统计学意义(P＜0.05)，因此，我们还不知晓miR-212在NAFLD治疗中的意义。再者，如果miR-212可作为NAFLD的治疗靶点，那么开发高效的药物则对于实现其在临床的应用来说非常重要。miRNA海绵是一种miRNA靶基因的竞争性抑制剂，是将若干个miRNA的反义序列串联在一起，连接到合适的载体中表达，其转录物“吸附”相应的miRNA，与miRNA靶基因形成竞争，导致靶基因去抑制化。目前未见以miR-212-3P为靶点设计的能高效治疗NAFLD的miRNA海绵产品。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于重组腺相关病毒8型的microRNA-212-3P海绵及其制备方法和应用。第一方面，本专利技术提供了一种miRNA-212-3P海绵表达载体，构建方法为：在基本载体pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP的多克隆位点连入序列如SEQIDNO:3的第442-569bp所示的序列。作为一个优选例，所述miRNA-212-3P海绵表达载体的序列如SEQIDNO:3所示。第二方面，本专利技术提供了所述miRNA-212-3P海绵表达载体在制备预防或治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。第三方面，本专利技术提供了所述miRNA-212-3P海绵表达载体的制备方法。第四方面，本专利技术提供了一种腺相关病毒，制备所述腺相关病毒采用的穿梭质粒是如上所述的miRNA-212-3P海绵表达载体。作为一个优选例，制备所述腺相关病毒采用的编码rep和cap蛋白编码基因的pAAV-RC为8型AAV。更优选地，所述腺相关病毒的制备方法包含以下步骤：将如上所述的miRNA-212-3P海绵表达载体，与pAAV-RC质粒和pHelper质粒共转染AAV-293细胞。第五方面，本专利技术提供了所述腺相关病毒在制备预防或治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。第六方面，本专利技术提供了所述腺相关病毒的制备方法。本专利技术优点在于：1、本专利技术明确了下调肝脏miR-212-3P的表达，降低了肝脏脂质积累，可以预防高脂饮食所致的NAFLD，为后期新药开发和临床治疗提供了明确的靶点和实验基础。2、本专利技术构建了miRNA-212-3P海绵表达载体，由于在基本载体选择、miRNA反义结合位点的序列和数量、间隔序列等方面设计恰当，该miRNA-212-3P海绵表达载体对于miRNA-212-3P的敲降效果显著高于研究过程中构建的其他海绵表达载体，动物实验也表明其对肝脏脂质积累、血清脂质含量的降低作用非常突出，显著优于其他海绵表达载体，取得了预料不到的技术效果，因此在临床药物开发中具有重要价值。3、本专利技术在腺病毒包装中使用pAAV-RC作为递送载体，其是8型AAV载体，对肝脏亲和力较好。附图说明附图1：microRNA表达变化的韦恩图。附图2：流式细胞术：调控miR-212-3P表达对脂质生成的影响。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，VSFFA+NC；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，VSBSA+NC。附图3：尼罗红染色：调控miR-212-3P表达对脂质生成的影响。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，VSFFA+NC；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，VSBSA+NC。附图4：各组小鼠肝脏病理切片油红O染色。附图5：各种小鼠血清及肝脏脂质变化。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，VSSD；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，VSHFD。附图6：A，三组肝脏变化(肉眼观)；B，敲减效率统计；C，脂滴减少统计；D，油红O变化；E，ALT和AST变化；F，三组肝脏TG、血清TG、血清NEFA变化。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1运动通过miR-212-3P调控非酒精性脂肪性肝病中的肝脏脂质积累1、方法将40只雄性C57/BL6小鼠随机分组，分为正常饮食组、正常饮食&运动组、高脂饮食组、高脂饮食&运动组(每组各10只)。正常饮食组和高脂饮食组分别饲喂标准饲料和高脂饲料，16周；正常饮食&运动组和高脂饮食&运动组在饲喂对应饲料的同时，予以60min/d,10m/min的跑步锻炼，共16周。四组小鼠于16周末腹腔麻醉后摘眼球法采血后处死动物，剪下完整肝本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种miRNA-212-3P海绵表达载体，其特征在于，构建方法为：在基本载体pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP的多克隆位点连入序列如SEQ ID NO:3的第442-569bp所示的序列。/n
【技术特征摘要】
1.一种miRNA-212-3P海绵表达载体，其特征在于，构建方法为：在基本载体pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP的多克隆位点连入序列如SEQIDNO:3的第442-569bp所示的序列。
2.根据权利要求1所述的miRNA-212-3P海绵表达载体，其特征在于，所述miRNA-212-3P海绵表达载体的序列如SEQIDNO:3所示。
3.权利要求1或2所述的miRNA-212-3P海绵表达载体在制备预防或治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。
4.权利要求1或2所述的miRNA-212-3P海绵表达载体的制备方法。
5.一种腺相关病毒，其特征在于，制备所...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨文卓，刘瑞麟，孙波，
申请(专利权)人：上海市同济医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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