利用阳离子多聚体DNA复合物促进AAV介导的基因表达方法技术

本发明专利技术公开了一种利用阳离子多聚体DNA复合物促进AAV介导的基因表达方法。所述基因表达方法包括：优选以包含目标基因的AAV载体、辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞；或者，先以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂孵育形成的阳离子多聚体DNA复合物和包含目标基因的AAV载体中的任意一者转染宿主细胞，之后以其中的另一者在设定时间内转染所述宿主细胞。本发明专利技术通过利用阳离子多聚体的本身特性，将其与AAV介导的基因治疗联合起来，进而提高AAV介导的基因表达效果，提高基因表达效率，并加强AAV介导的基因治疗效果，对推动基因治疗、细胞治疗、细胞工程等领域发展有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
利用阳离子多聚体DNA复合物促进AAV介导的基因表达方法
本专利技术涉及一种促进AAV介导的基因表达方法，具体的，尤其涉及一种利用阳离子多聚体DNA复合物促进AAV介导的基因表达方法，属于基因工程

技术介绍
基因治疗是现在人类治疗肿瘤、传染病、遗传病的重要技术手段，指将特定的外源基因通过多种方式导入到目的细胞内以达到治疗甚至彻底治愈疾病的一种有效的方案。其中基因治疗最为关键的技术，即选用合适方式或者载体将用来治疗的外源基因，稳定、安全地导入目的细胞中，并高效的进行治疗。不同的方式和载体的递送效率，极大的影响着后续的研究和临床治疗效果。因此，专利技术出一种用于高效促进载体表达的方法是亟需必要的。目前，用于基因递送的载体主要分为病毒载体和非病毒载体。AAV作为重要的病毒载体，在科学研究和临床应用中都有着很广泛的应用。AAV是一种细小病毒，自然缺陷、无包被和无致病原性。AAV基因组是一个线性、单链DNA(ssDNA)分子，由4680个核苷酸构成，在每个末端含有一个145个碱基组成的末端重复序列(ITR)。随着AAV的研究发展，其在科学研究和临床应用上逐步成为主要的基因载体。因此有效的提高AAV介导的基因治疗是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种利用阳离子多聚体DNA复合物促进AAV介导的基因表达方法，以克服现有技术中的不足。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种利用阳离子多聚体DNA复合物促进AAV介导的基因表达方法，其包括：以包含目标基因的AAV载体、辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞；或者，先以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂孵育形成的阳离子多聚体DNA复合物和包含目标基因的AAV载体中的任意一者转染宿主细胞，之后以其中的另一者在设定时间内转染所述宿主细胞。在一些优选实施例中，所述基因表达方法包括：以包含目标基因的AAV载体、辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞；或者，先以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞，之后再在选定时间内以包含目标基因的AAV载体转染所述宿主细胞，所述设定时间小于24h，优选小于12h，更优选为6h以内；或者，先以包含目标基因的AAV载体转染宿主细胞，之后再在选定时间内以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染所述宿主细胞，所述设定时间小于24h以内，优选小于6h；其中同时转染为最佳。进一步地，所述基因表达方法包括：将辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂在选定缓冲液中混合反应，形成阳离子多聚体DNA复合物；以及以所述阳离子多聚体DNA复合物转染宿主细胞。与现有技术相比，本专利技术的有益效果至少在于：本专利技术提供的利用阳离子多聚体DNA复合物促进AAV介导的外源基因的表达能力和增强其表达时间的方法，通过利用阳离子多聚体的本身特性，将其与AAV介导的基因治疗联合起来，进而提高AAV介导的基因表达效果，提高基因表达效率，并加强AAV介导的基因治疗效果，对推动基因治疗、细胞治疗、细胞工程等领域发展有着至关重要的意义。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例1中SDS-PAGE电泳检测rAAV载体纯度的示意图。图2A是本专利技术实施例1中不同细胞密度下，阳离子聚合物PEI-DNA介导的AAV表达荧光显微镜观察结果图。图2B是本专利技术实施例1中不同细胞密度下，阳离子聚合物PEI-DNA介导的AAV表达流式分析结果图。图3A是本专利技术实施例1中阳离子多聚体PEI-DNA介导的不同MOI的AAV载体的基因表达荧光显微镜观察结果图。图3B是本专利技术实施例1中阳离子多聚体PEI-DNA介导的不同MOI的AAV载体的基因表达流式分析结果图。图4A是本专利技术实施例1中阳离子多聚体PEI-DNA介导的不同时间的AAV载体的基因表达荧光显微镜观察结果图。图4B是本专利技术实施例1中阳离子多聚体PEI-DNA介导的不同时间的AAV载体的基因表达流式分析结果图。图5A是本专利技术实施例1中阳离子多聚体PEI-DNA介导的不同时间点的AAV载体的基因表达荧光显微镜观察结果图。图5B是本专利技术实施例1中阳离子多聚体PEI-DNA介导的不同时间点的AAV载体的基因表达流式分析结果图。图6A是本专利技术实施例1中阳离子多聚体PEI-DNA在不同的比例条件下介导的AAV载体的基因表达荧光显微镜观察结果图。图6B是本专利技术实施例1中阳离子多聚体PEI-DNA在不同的比例条件下介导的AAV载体的基因表达流式分析结果图。具体实施方式rAAV载体以非致病性、低免疫原性、稳定表达目的基因等优点成为最有前景的病毒载体，被广泛应用于视网膜病变的基因治疗。阳离子多聚体作为非病毒载体，具有无传染性、来源广、可大量制备等优点，被广泛应用于基因治疗及细胞治疗等基础研究中。阳离子多聚体聚乙烯酰胺(PEI)，因为其具有良好的“质子海绵”效应，和较高效的基因递送效率已成为了基因递送的重要方式，它是分子量在200Da至1500kDa左右的合成高分子，主要有分支状和线性两种结构形式，其中分子量更小的线性PEI具有更加优良的递送效果。鉴于现有技术的不足，本案专利技术人经长期研究和大量实践，得以提出本专利技术的技术方案，其主要是通过利用阳离子多聚体的本身特性，将其与AAV介导的基因治疗联合起来，进而提高AAV介导的基因表达效果，并加强AAV介导的基因治疗效果。经过阳离子多聚体与AAV载体的共同使用，提供一种有效提高AAV介导的基因表达的方法，即利用阳离子多聚体DNA复合物高效提高AAV介导的外源基因的表达能力和增强其表达时间的方法，对推动基因治疗、细胞治疗、细胞工程等领域发展有着至关重要的意义。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。本专利技术实施例的一个方面提供了一种利用阳离子多聚体DNA复合物促进AAV介导的基因表达方法，其包括：以包含目标基因的AAV载体、辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞；或者，先以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂孵育形成的阳离子多聚体DNA复合物和包含目标基因的AAV载体中的任意一者转染宿主细胞，之后以其中的另一者在设定时间内转染所述宿主细胞。在一些优选实施例中，所述基因表达方法包括：以包含目标基因的AAV载体、辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞；或者，先以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞，之后再在选定时间内以包含目标基因的AAV载体转染所述宿主细胞，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用阳离子多聚体DNA复合物促进AAV介导的基因表达方法，其特征在于包括：/n以包含目标基因的AAV载体、辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞；/n或者，先以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂孵育形成的阳离子多聚体DNA复合物和包含目标基因的AAV载体中的任意一者转染宿主细胞，之后以其中的另一者在设定时间内转染所述宿主细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用阳离子多聚体DNA复合物促进AAV介导的基因表达方法，其特征在于包括：
以包含目标基因的AAV载体、辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞；
或者，先以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂孵育形成的阳离子多聚体DNA复合物和包含目标基因的AAV载体中的任意一者转染宿主细胞，之后以其中的另一者在设定时间内转染所述宿主细胞。


2.根据权利要求1所述的基因表达方法，其特征在于包括：
以包含目标基因的AAV载体、辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞；
或者，先以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞，之后再在选定时间内以包含目标基因的AAV载体转染所述宿主细胞，所述设定时间小于24h，优选小于12h，更优选为6h以内；
或者，先以包含目标基因的AAV载体转染宿主细胞，之后再在选定时间内以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染所述宿主细胞，所述设定时间小于24h以内，优选小于6h；其中同时转染为最佳。


3.根据权利要求1所述的基因表达方法，其特征在于包括：
以包含目标基因的AAV载体、辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞，并进行基因表达24h以上，优选48h以上，尤其优选72h以上；
或者，先以辅助DNA与带正电荷的细胞转染试剂孵育形成的阳离子多聚体DNA复合物和包含目标基因的AAV载体中的任意一者转染宿主细胞，之后以其中的另一者在设定时间内转染所述宿主细胞，并进行基因表达24h以上，优选48h以上，尤其优选72h以上。


4.根据权利要求1所述的基因表达方法，其特征在于包括：当以包含目标基因的AAV载体、辅...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵嘉红，张宗德，谈鹏程，赵晓明，吴相，盛必成，
申请(专利权)人：苏州吉恒基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32