衣壳蛋白融合细胞穿膜肽的腺相关病毒突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种衣壳蛋白融合细胞穿膜肽的腺相关病毒突变体及其应用。本发明专利技术还公开了一种AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其与亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中插入有细胞穿膜肽的氨基酸序列。所述衣壳蛋白融合细胞穿膜肽的腺相关病毒突变体包含所述AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段。本发明专利技术将细胞穿膜肽以融合表达的方式直接插入AAV衣壳蛋白中，将穿膜肽牢固的融合在AAV衣壳蛋白中，能够显著提高AAV转染细胞的能力和转导效率，以及提高基因表达效率，可降低病毒用量，进而降低免疫原性，将有利于推动AAV病毒基因载体在基因治疗相关领域中的应用。因载体在基因治疗相关领域中的应用。因载体在基因治疗相关领域中的应用。

【技术实现步骤摘要】
functionalities in poly(amido amine)s for non
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viral gene transfection.J Control Release,2008,132:267
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272；Moreira,C,Oliveira,H,Pires,LR,S,Barbosa,MA and P
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go,AP.Improvingchitosan
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mediated gene transfer by the introduction of intracellular buffe ring moietiesinto the chitosan backbone.Acta Biomater,2009,5:2995
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3006；Pack,DW,Putnam,D and Langer,R.Design of imidazole
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containing endosomolytic biopolymers for gene delivery.Biotechnol Bioeng,2000,67:217
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223)。常使用的穿膜肽主要有LAH4、Antp、TAT
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HA2等。LAH4是优先选择的一种富含组氨酸的多肽家族，其复合物与细胞膜结合后会形成两亲螺旋构象。
[0005]研究表明，细胞穿膜肽(CPP)首先可以通过促进细胞的内吞作用增加AAV颗粒进入细胞；还可以帮助AAV避开胞内酪氨酸激酶的识别，降低磷酸化水平，减少被蛋白酶体的降解；此外，LAH4此类多肽上的组氨酸在酸性pH条件下能够形成特殊构象，逃逸溶酶体的识别，且其更容易与带阴离子的脂质膜结合，这种螺旋肽能使脂质脂酰基链发生紊乱，有利于AAV逃逸内涵体，由此，显著提高AAV转导细胞的效率(Liu Y,Kim YJ,Ji M,Fang J,Siriwon N,Zhang LI,Wang P.Enhancing gene delivery of adeno
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associated viruses by cell
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permeable peptides.Mol Ther Methods Clin Dev.2014 Feb 19；1:12)。目前报道的CPP促进AAV转导细胞效率的方法是，将AAV病毒粒子和穿膜肽混合温育形成复合物。
[0006]通过物理孵育的方法生成AAV病毒粒子和LAH4复合物的方法存在很多的问题：首先，AAV病毒粒子与LAH4的结合是物理结合的，不够稳定，在转导细胞的时候会产生脱离状况，达不到提高AAV转导效率的目的，也会造成使用风险；其次，进行孵育的时候，时间的长短会在很大程度上影响结合率，可能存在不完全结合的状态；此外，孵育时AAV用量大，LAH4需要额外合成，这些都使得成本的增加。由此可见，通过物理孵育的技术将病毒粒子和穿膜肽结合在一起，提高AAV转导效率的方法在应用上受到很大的限制。

技术实现思路

[0007]本专利技术的主要目的在于提供一种衣壳蛋白融合细胞穿膜肽的腺相关病毒突变体及其应用，以克服现有技术中的不足。
[0008]为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：
[0009]本专利技术实施例提供了一种AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，所述AAV衣壳蛋白突变体与亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中插入有细胞穿膜肽的氨基酸序列。
[0010]本专利技术实施例还提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码前述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段的核酸序列。
[0011]本专利技术实施例还提供了一种载体，其中包含前述的分离的多核苷酸。
[0012]本专利技术实施例还提供了一种宿主细胞，其中包含前述的多核苷酸或者载体。
[0013]本专利技术实施例提供了一种衣壳蛋白融合细胞穿膜肽的腺相关病毒突变体，其中包含前述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段。
[0014]本专利技术实施例还提供了一种重组腺相关病毒粒，其包含：
[0015]前述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段；以及
[0016]编码外源基因产物的外源多核苷酸。
[0017]本专利技术实施例还提供了一种衣壳蛋白融合细胞穿膜肽的腺相关病毒突变体的制备方法，其包括：构建包含前述的分离的多核苷酸的重组杆状病毒载体，再利用杆状病毒
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昆虫细胞生产系统生产衣壳蛋白融合细胞穿膜肽的腺相关病毒突变体。
[0018]本专利技术实施例还提供了一种药物组合物，其包含前述的衣壳蛋白融合细胞穿膜肽的腺相关病毒突变体或者重组腺相关病毒粒；以及，药学上可接受的赋形剂。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果至少在于：
[0020]本专利技术将细胞穿膜肽以融合表达的方式直接插入AAV衣壳蛋白中，将穿膜肽牢固的融合在AAV衣壳蛋白中，可以稳定增加AAV进入细胞的比例，能够显著提高AAV转染细胞的能力和转导效率，以及提高基因表达效率，可降低病毒用量，进而降低免疫原性。相比于目前的技术，将AAV和细胞穿膜肽通过孵育结合的方式，本专利技术是通过融合表达的方法，细胞穿膜肽与AAV衣壳蛋白的结合率高，不会发生解离，融合过程简单，节约成本。本专利技术的技术将有利于推动AAV病毒基因载体在基因治疗相关领域中的应用。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1A
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图1B分别是本专利技术实施例1中重组质粒pFastbacdual
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inCap6
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LAH4和pFastbacdual
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inCap6的图谱。
[0023]图2A是本专利技术实施例1中重组病毒衣壳蛋白SDS
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PAGE电泳图。
[0024]图2B和图2C分别是本专利技术实施例1中rAAV6
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EGFP和rAAV6
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LAH4
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EGFP转染HepG2细胞荧光显微镜观察结果和流式细胞仪检测结果图。
[0025]图3A
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图3D分别是本专利技术实施例1中野生型和突变型AAV转染人脐带血间充质干细胞MSC荧光显微镜观察结果和流式细胞仪检测结果图。
[0026]图4A
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图4D分别是本专利技术实施例1中野生型和突变型AAV转染人视网膜色素上皮细胞ARPE
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19荧光显微镜观察结果和流式细胞仪检测结果图。
[0027]图5A
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图5D分别是本专利技术实施例1中野生型和突变型AAV转染人Burkitt's淋巴瘤细胞系本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，所述AAV衣壳蛋白突变体与亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中插入有细胞穿膜肽的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其特征在于：所述细胞穿膜肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和/或，所述细胞穿膜肽具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列；和/或，所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白包括6型AAV衣壳蛋白、2型AAV衣壳蛋白中的任一种；其中，当选择2型AAV衣壳蛋白时，所述2型AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列；和/或，所述2型AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；2型AAV衣壳蛋白融合细胞穿膜肽的腺相关病毒突变体具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列；和/或，2型AAV衣壳蛋白融合细胞穿膜肽的腺相关病毒突变体具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；当选择6型AAV衣壳蛋白时，所述6型AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列；和/或，所述6型AAV衣壳蛋白具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵嘉红，潘丽萍，赵晓明，吴相，谈鹏程，荀婷君，雷真真，陆阳，
申请(专利权)人：苏州吉恒基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：