一种犬细小病毒的三价抗原和三价病毒样颗粒以及应用制造技术

本发明专利技术公开一种犬细小病毒的三价抗原和三价病毒样颗粒以及应用，属于生物医学技术领域。为了提供一种安全性高，保护期长，免疫效果好的犬细小病毒的三价疫苗。本发明专利技术提供一种犬细小病毒的三价抗原是由犬细小病毒new CPV

【技术实现步骤摘要】
一种犬细小病毒的三价抗原和三价病毒样颗粒以及应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种犬细小病毒的三价抗原和三价病毒样颗粒以及应用。

技术介绍

[0002]犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一种急性、高度接触性传染性肠炎疾病，主要以呕吐剧烈、腹泻、粪便有恶臭味、出血性肠炎和白细胞数量减少为特征。
[0003]1978年第一次分离出CPV，被命名为CPV
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2型。CPV
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2型可感染犬但不能感染猫。1980年，Parrish等发现新的变异株CPV
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2a，CPV
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2a与CPV
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2的VP2有5个氨基酸变异，导致病毒与单克隆抗体的反应特性、与猫转铁蛋白受体亲和性和猫体内复制能力均发生改变，CPV
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2a逐渐取代了CPV
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2在世界范围内流行。1984年，CPV
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2b型被发现，CPV
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2a和CPV
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2b逐渐取代了CPV
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2，CPV
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2a和CPV
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2b对犬的细胞更适应并且扩大了宿主的范围，不仅可以感染犬，在一定情况下还可以感染猫。2000年Ikeda等在豹猫中分离到一种新的细小病毒变异株，但不和CPV的另几种单抗反应，因此被认为该病毒是新的抗原型并命名为CPV
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2c。CPV
‑<br/>2c比起CPV
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2a和CPV
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2b对猫的致病能力强。此外，还有new CPV
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2a、new CPV
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2b、CPV
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2c(a)、CPV
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2c(b)毒株陆续被发现，均是VP2关键氨基酸位点发生变异。我国目前主要是以new CPV
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2a、new CPV
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2b为主，偶发CPV
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2c，这提示CPV在长期进化和免疫压力下已经发生了变异，这可能也是临床上CPV感染病例逐渐增多和免疫犬发病的重要原因之一。
[0004]犬细小病毒病没有有效的治疗办法，主要依靠接种疫苗进行免疫预防。现有疫苗为弱毒疫苗和灭活疫苗。弱毒苗免疫犬后，病毒能在犬体内增殖，可能将疫苗毒排出传递给未免疫的犬，或毒株突变、毒力返强而爆发疾病；灭活疫苗由于病毒的核酸已被破坏，使得病毒已不具有感染性，所以其安全性高且不存在散毒的风险，但免疫持续期短。且目前商品化的疫苗只有以CPV
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2型或CPV
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2b型病毒基础上制备的，均为弱毒疫苗，这导致国内流行毒株与疫苗毒株不匹配，且现有毒株疫苗对新型突变株的保护性明显降低，国内外均有犬群接种疫苗后仍暴发CPV的报道。因此，制备新型CPV疫苗的呼声渐长，以流行毒株分离株为疫苗用毒研制出新型的犬细小病毒三价疫苗是非常必要的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了提供一种安全性高，保护期长，免疫效果好的犬细小病毒的三价疫苗。
[0006]本专利技术提供一种犬细小病毒的三价抗原，所述三价抗原是由犬细小病毒new CPV
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2a的VP2的氨基酸序列、犬细小病毒new CPV
‑
2b的VP2的氨基酸序列和犬细小病毒CPV
‑
2c的VP2的氨基酸序列组成的。
[0007]进一步地限定，所述犬细小病毒new CPV
‑
2a的VP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述犬细小病毒new CPV
‑
2b的VP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述犬细小病
毒CPV
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2c的VP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
[0008]进一步地限定，犬细小病毒new CPV
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2a的VP2的基因序列如SEQ ID NO.5所示；犬细小病毒new CPV
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2b的VP2的基因序列如SEQ ID NO.6所示；犬细小病毒CPV
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2c的VP2的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
[0009]本专利技术提供一种重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒是以E.coli DH10 Bac为出发菌，表达上述三价抗原获得的重组微生物，然后利用重组微生物感染Sf9细胞、Sf21细胞或High Five细胞获得的。
[0010]本专利技术提供一种犬细小病毒的三价病毒样颗粒，其特征在于，所述三价病毒样颗粒是利用上述的重组杆状病毒感染Sf9细胞、Sf21细胞或High Five细胞，经过离心后收集细胞培养物经过细胞裂解处理后获得的。
[0011]本专利技术提供上述的三价病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法如下：
[0012]步骤1：将CP
‑
2A
‑
opt基因序列、CP
‑
2B
‑
opt基因序列和CP
‑
2C
‑
opt基因序列连接至转移载体pFF获得重组载体pFF
‑
CP
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ABC；所述CP
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2A
‑
opt基因序列如SEQ ID NO.2所示；CP
‑
2B
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opt基因序列如SEQ ID NO.3所示；CP
‑
2C
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opt基因序列如SEQ ID NO.4所示；
[0013]步骤2：将重组载体pFF
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CP
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ABC利用热休克方法转化E.coli DH10 Bac感受态获得重组杆状病毒Bac
‑
CPV
‑
ABC；
[0014]步骤3：将重组杆状病毒Bac
‑
CPV
‑
ABC转染贴壁Sf9细胞，收集细胞培养物，离心10min，分离上清液和细胞，细胞加入NaHCO3悬浮处理后，离心后获取上清液。
[0015]进一步地限定，步骤1中获得转移载体pFF的方法如下：
[0016]步骤1.1：pFastBacDual载体p10启动子下的MCS中，将Kpn I至Nhe I的序列删除；将pH启动子下MCS中的Rsr II至Spe I的序列删除获得质粒pFD(k+n)(r+s)，将基因序列10H通过BstZ17 I酶切位点连入质粒pFD(k+n)(r+s)；
[0017]步骤1.2：将合成的序列10H的基因序列如SEQ ID NO.1所示，通过BstZ17 I酶切位点连入质粒pFD(k+n)(r+s)获得转移载体pFF，转移载体pFF的序列如SEQ ID NO.21所示。
[0018]本专利技术一种犬细小病毒的三价疫苗，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种犬细小病毒的三价抗原，其特征在于，所述三价抗原是由犬细小病毒new CPV
‑
2a的VP2的氨基酸序列、犬细小病毒new CPV
‑
2b的VP2的氨基酸序列和犬细小病毒CPV
‑
2c的VP2的氨基酸序列组成的。2.根据权利要求1所述的三价抗原，其特征在于，所述犬细小病毒new CPV
‑
2a的VP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述犬细小病毒new CPV
‑
2b的VP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述犬细小病毒CPV
‑
2c的VP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。3.根据权利要求1所述的三价抗原，其特征在于，犬细小病毒new CPV
‑
2a的VP2的基因序列如SEQ ID NO.5所示；犬细小病毒new CPV
‑
2b的VP2的基因序列如SEQ ID NO.6所示；犬细小病毒CPV
‑
2c的VP2的基因序列如SEQ ID NO.7所示。4.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒是以E.coli DH10 Bac为出发菌，表达权利要求1
‑
3任一项所述三价抗原获得的重组微生物，然后利用重组微生物感染Sf9细胞、Sf21细胞或High Five细胞获得的。5.一种犬细小病毒的三价病毒样颗粒，其特征在于，所述三价病毒样颗粒是利用权利要求4所述的重组杆状病毒感染Sf9细胞、Sf21细胞或High Five细胞，经过离心后收集细胞培养物经过细胞裂解处理后获得的。6.权利要求5所述的三价病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法如下：步骤1：将CP
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2A
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opt基因序列、CP
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2B
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opt基因序列和CP
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2C
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opt基因序列连接至转移...

【专利技术属性】
技术研发人员：王化磊，夏振强，金宏丽，黄培，石晶，刘迪，焦翠翠，白玉洁，李媛媛，张海丽，陶志，
申请(专利权)人：长春西诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：