因子VIII或因子IX基因敲除兔、其制备方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种因子VIII或因子IX基因敲除兔、其制备方法及其用途；更具体地涉及已通过CRISPR/Cas9系统敲除因子VIII或因子IX基因的转基因兔、其制备方法及其用途。根据本发明专利技术，在已经敲除因子VIII和/或因子IX基因的转基因兔中，作为对于血友病发展发挥关键功能的蛋白质的因子VIII和/或因子IX的功能受到抑制，使得所述转基因兔可用于血友病治疗的开发。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】因子VIII或因子IX基因敲除兔、其制备方法及其用途
本专利技术涉及因子VIII或因子IX基因敲除兔、其产生方法及其用途。更具体地，本专利技术涉及使用CRISPR/Cas9系统敲除因子VIII或因子IX基因的转基因兔、其产生方法及其用途。
技术介绍
凝血是响应于血管损伤而发生的复杂且必要的过程。这是通过形成血栓来实现的，所述血栓止血并开始修复受损的血管；受损部位被血纤蛋白和血小板(包括血栓)覆盖。所述过程几乎在损伤后立即开始。凝血过程涉及两种类型的成分：称为“血小板”的细胞成分和称为“凝血因子”的蛋白质成分。血小板立即在受伤部位形成栓塞，这被称为“初级止血”。次级止血是指一种现象，其中血浆中同时出现并称为凝血因子或凝结因子的蛋白质通过复杂的级联过程反应以形成增强血小板栓塞的血纤蛋白束。次级止血的凝血级联分为两个途径：内源性途径(也称为“接触激活途径”)和外源性途径(也称为“组织因子途径”)。辅因子和调节剂以及许多凝血因子参与保持所述过程的准确性。例如，蛋白C是凝血调节的主要机制中的必要因子，称为“抗凝途径”。蛋白C的活性形式(激活蛋白C)是丝氨酸蛋白酶，其分解凝血级联的两个因子，即因子Va和VIIIa，所述两个因子当与其他辅因子(蛋白S)缔合时对于凝血酶的大量产生是必要的。这些因子的破坏(分解)负调节所形成的凝血酶的量，从而导致抗凝作用。已知所述蛋白质具有多效生物活性，具体地抗血栓形成活性、抗炎活性、抗凋亡活性和促纤溶活性。因子IX(以下称为“FIX”)是对于凝血而言必要的丝氨酸蛋白酶。该蛋白质的缺乏导致出血性障碍，称为“乙型血友病”。在凝血过程中，激活的FIX(FIXa)与其激活的辅因子即因子VIIIa(以下称为“FVIIIa”)组合，将特定的底物因子X(以下称为“FX”)转化为激活的因子X(以下称为“FXa”，是因子X的激活的衍生物)。因子X是凝血级联的另一个必要因子。FX的激活形式(FXa)是能够与其辅因子(凝血因子Va)组合以将凝血酶原激活为凝血酶的唯一的丝氨酸蛋白酶。此外，长期以来一直被认为是被动旁观者的因子X是通过激活其两种主要受体(即蛋白酶激活的受体1(PAR-1)和PAR-2)而直接参与多种细胞类型的成分。最近的发现已经表明，PAR-2是调节凝血与疾病进展之间的联系并在因子X方面和在纤维化疾病(如纤维化、组织重塑和癌症)中发挥重要作用的重要介质(Borensztajn等人,AmJPathol.2008；172:309-20)。在负责人体止血的各种凝血因子中，因子VIII的缺乏被称为“甲型血友病”，并且因子IX的缺乏被称为“乙型血友病”。除血管性血友病(vonWillebranddisease)外，甲型血友病是世界上最常见的遗传性凝血病，占所有血友病的约80％至85％，并且发病率为5,000至10,000个活产男孩中之一。乙型血友病更为罕见，并且估计为甲型血友病的约1/5。正常受试者具有约50％至150％的因子VIII和因子IX活性，并且在血液测试中展现出降低的甲型血友病和乙型血友病活性。根据凝血因子的活性，血友病分为严重(因子VIII或因子IX活性为1％或更小)、中度(所述因子活性为1％至5％)、轻度(所述因子活性为5％至30％)和低于正常(所述因子活性为30％到50％)，并且症状根据严重程度而变化。例如，在患有严重甲型血友病的患者中，在没有特殊创伤的任何时候都可能发生自发性出血。在开发出治疗剂(因子VIII浓缩物)之前，平均预期寿命由于脑出血而仅有25年。就严重程度分布而言，严重、中度和轻度甲型血友病患者的发病率分别为约70％、15％和15％，并且严重、中度和轻度乙型血友病患者的发病率分别为约50％、30％和20％。众所周知，出血的发病率对于严重患者是每周一次，对于中度患者是每月一次，并且对于轻度患者是每年一次。关节和肌肉是最常见的出血部位。特别地，在15与25岁之间关节出血特别值得注意，并且当重复出血时，患者平均50岁时会由于血友病性关节病而患上关节挛缩。使用药物治疗血友病时，预测抑制剂发展(抗体产生)反应非常重要。在甲型血友病患者和乙型血友病患者中，抑制剂发展反应的发生率分别为约30％和3％(KesslerCM,Hematology.Am.Soc.Hematol.Educ.Program.2005:429-35)。血友病药物的抗体最常在暴露于药物后50天内产生，并且通常分类为展现0.6或更高的贝塞斯达单位(Bethesdaunit，BU)的抗体产生组和展现5BU或更高的超抗体产生组(KasperCK等人,Thromb.Diath.Haemorrh.1975；34(2):612；VerbruggenB等人,Thromb.Haemost.1995；73(2):247-51；VielKR等人,N.Engl.J.Med.2009；360(16):1618-27；KemtonCL等人,Blood.2009；113(1):11-7)。治疗具有抗体产生反应的患者非常困难，特别是，他们经常由于频繁出血而患有关节并发症(ParkYS,JKoreanMedAssoc2009；52(12):1201-6)。替代疗法包括给予旁路因子(bypassingfactor)，如激活凝血酶原复合物和因子VII重组剂，但可能更优选的是通过免疫耐受从具有抗体产生反应的组中去除抗体(KemtonCL等人,Blood.2009；113(1):11-7；ParkYS,J.KoreanMed.Assoc.2009；52(12):1201-6)。免疫耐受的成功率从30％到80％变化，并且在免疫耐受后，患者可以继续使用不变的因子VIII或因子IX剂(ParkYS,J.KoreanMed.Assoc.2009；52(12):1201-6)。已经对血友病治疗的抗体产生反应的主要预测因子或原因进行了若干项研究。在基因预测因子中，已知F8基因的缺陷是最大的原因(SchwaabR等人,Thromb.Haemost.199574(6):1402-6；OldenburgJ等人,Thromb.Haemost.1997,77(2):238-42)并且位于基因(如MHCII、TNF-α、IL-10和CTLA-4)中的单核苷酸多态性(SNP)突变也被认为具有显著的统计学关联性，但是据预测，有许多基因预测因子尚未被鉴定(HayCR等人,Thromb.Haemost.199777(2):234-7；OldenburgJ等人,Thromb.Haemost.1997；77(2):238-42；AstermarkJ等人,Blood.2006a,107(8):3167-72；AstermarkJ等人,Blood.2006b,108(12):3739-45；AstermarkJ等人,JThromb.Haemost.2007,5(2):263-5)。与此同时，自从在2012年将保护微生物免受病毒侵害的免疫系统CRISPR/Cas系统引入异源细胞，已经显示所述系统用于选择性切割靶碱基序列和用于编辑从微生物细胞到人类细胞的多种细胞的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SgRNA，所述SgRNA包含与因子VIII(FVIII)或因子IX(FIX)的外显子区域互补结合的靶向结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170928 KR 10-2017-01260681.一种SgRNA，所述SgRNA包含与因子VIII(FVIII)或因子IX(FIX)的外显子区域互补结合的靶向结构域。


2.根据权利要求1所述的sgRNA，其中所述因子VIII(FVIII)基因的外显子区域是由SEQIDNO:1的碱基序列表示的外显子区域。


3.根据权利要求1所述的sgRNA，其中所述因子IX(FIX)基因的外显子区域是由SEQIDNO:2的碱基序列表示的外显子区域。


4.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至3中任一项所述的sgRNA。


5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQIDNO:3至6中的任何一个的碱基序列表示。


6.一种载体，所述载体具有插入其中的根据权利要求4所述的多核苷酸。


7.一种CRISPR/Cas系统，所述CRISPR/Cas系统包含根据权利要求6所述的载体。


8.一种转基因兔，所述转基因兔使用根据权利要求7所述的CRISPR/Cas9系统产生。


9.根据权利要求8所述的转基因兔，其中通过如下方法产生所述转基因兔，所述方法包括：
(a)转录根据权利要求7所述的CRISPR/Cas9系统以产生sgRNA和Cas9mRNA；
(b)将步骤(a)中产生的mRNA引入胚胎中并培养所述胚胎；以及
(c)将步骤(b)中获得的胚胎移植到代孕母体中以产生所述转基因兔。


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【专利技术属性】
技术研发人员：金少罗，郑明恩，金民静，曺胜贤，黄成虎，郭曦天，李秀珉，南铉子，
申请(专利权)人：株式会社绿十字，财团法人牧岩生命科学研究所，
类型：发明
国别省市：韩国;KR