CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA小鼠模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种CD8定点基因敲入2A‑CreERT2‑Wpre‑pA小鼠模型的构建方法及应用，首先构建CD8定点基因敲入2A‑CreERT2‑Wpre‑pA的重组打靶载体，并转染到供体小鼠受精卵，之后移植到假孕母鼠的子宫中生产出嵌合体小鼠；所述嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得F1代；将所述F1代与基因型为Tg

【技术实现步骤摘要】
CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA小鼠模型的构建方法及应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA小鼠模型的构建方法及应用。
技术介绍
基因敲入是指对一个结构已知但功能有待阐明的基因，从分子水平上设计实验，将该基因体内过表达，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。CD8+T细胞可以清除肿瘤细胞或者被病毒感染的细胞，在肿瘤免疫及感染免疫中起至关重要的作用。然而，由于人源性和鼠源性的CD8+T细胞均不易转染外源性基因，并且该类细胞体外大量培养非常困难。因此，构建CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA工具小鼠模型为研究某些基因对CD8+T细胞的影响的作用机制至关重要。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA工具小鼠模型的构建方法。利用本专利技术的构建方法可以调控CD8+细胞中目的基因表达，为有目的的研究CD8+细胞中目的基因对CD8+细胞发育及分化，肿瘤免疫中的作用机制提供理想模型。本专利技术所采用的技术方案为：一种CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：(1)构建CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA的重组打靶载体；(2)将所述重组打靶载体转染到供体小鼠受精卵中，得到转染受精卵；(3)将所述转染受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，生产出F0代小鼠；对所述F0代小鼠进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为嵌合体小鼠；(4)将所述嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，获得后代小鼠并进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为F1代小鼠；(5)将所述F1代小鼠与基因型为Tgf/+或Tgf/f的小鼠交配获得F2代小鼠；(6)将所述F2代小鼠与基因型为Tgf/+或Tgf/f的小鼠相互近交获得F3代小鼠；(7)对F3代小鼠给予诱导，得到所述小鼠模型。进一步地，步骤(1)中，所述构建CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA的重组打靶载体，具体操作如下：通过同源重组的方式将所述2A-CreERT2-Wpre-pA基因在CD8基因终止密码子位点定点敲入2A-CreERT2-Wpre-pA得到CD8-2A-CreERT2-Wpre-pA表达框，进而获得所述CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA的重组打靶载体。进一步地，所述重组打靶载体包含2.9kb5’同源臂、2A-CreERT2-Wpre-pA和3.0kb3’同源臂。进一步地，步骤(2)中，与所述重组打靶载体同时转染到小鼠受精卵中的还有Cas9mRNA和gRNA。进一步地，所述gRNA序列为5’-TTGTGTAAAATGGCACCGCCAGG-3’，如SEQIDNO:1所示。进一步地，步骤(2)中，所述供体小鼠为C57BL/6J小鼠；步骤(3)中，所述假孕母鼠为C57BL/6J小鼠。进一步地，步骤(3)中，所述对F0代小鼠鉴定采用的为PCR鉴定方法；所述PCR鉴定方法采用的5’臂的引物序列为I：5’-TTGGTGGGGACTTTGGGTGACATC-3’和II：5’-GGCAGCAGGAAGACAACAAGACAT-3’，如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，采用的3’臂的引物序列为III：5’-CACAGGCACCCGAACTCCGAATCT-3’和IV：5’-CACTTGGCGCTTGTATGTATGCTC-3’，如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；所述PCR鉴定方法的反应条件为：94℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃5min，68℃5min，共35个循环。进一步地，5’臂同源重组阳性基因组应扩增出6.4kb片段，阴性基因组应扩增出8.0kb片段；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.3kb片段，阴性基因组应扩增出6.6kb片段。进一步地，步骤(4)中，所述对F1代鉴定采用的为PCR鉴定方法。进一步地，所述PCR鉴定方法采用的5’臂的引物序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，采用的3’臂的引物序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；所述PCR鉴定方法的反应条件为：94℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃5min，68℃5min，共35个循环。进一步地，步骤(4)中，所述F1代小鼠是基因型为CD8ERT2Cre+的杂合小鼠。进一步地，步骤(5)中，所述F2代小鼠表达的基因型为Tgf/+；CD8ERT2Cre+的小鼠。进一步地，步骤(6)中，所述F3代小鼠表达的基因型为Tgf/f；CD8ERT2Cre+。进一步地，步骤(7)中，所述给予诱导为给予他莫昔芬诱导，所述他莫昔芬的用量为0.5M/g体重，连续给药5天。所述CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA的小鼠模型在目的基因Cd8a对CD8+细胞发育和分化相关研究中的应用。基因型为Tgf/+或Tgf/f的小鼠：拥有floxed基因序列的条件性转基因的小鼠；目的基因名称(Ensembl号)：Cd8a(ENSMUSG00000053977)；Ensembl号：Cd8a-201(ENSMUST00000066747.13)；敲入位置：终止密码子；敲入片段名称：2A-CreERT2-Wpre-pA；2A-CreERT2-Wpre-pA共表达结构的功能等描述：Cre-ERT2是一类含有雌激素受体(estrogenreceptor，ER)的配体结合区突变体(ERT)与Cre重组酶的融合蛋白表达。Cre-ERT2在无Tamoxifen诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT(雌激素类似物)与ERT结合，可使Cre-ERT2进核发挥Cre重组酶活性。将2A-CreERT2-WPRE-pA共表达结构定点插入到小鼠内源Cd8基因终止密码子位点，建立Cd8-CreERT2基因敲入工具鼠模型。诱导型CreERT2受内源Cd8基因启动子驱动，可用于在T细胞中敲除floxed基因序列。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA小鼠模型的构建方法，通过同源重组的方式，在CD8基因终止密码子定点插入2A-CreERT2-Wpre-pA表达框构建同源重组载体；将Cas9mRNA、gRNA和同源重组载体显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，之后将注射后的受精卵移植到假孕母鼠的子宫中生产出嵌合体小鼠；所述嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得F1代小鼠；将所述F1代小鼠与基因型为Tgf/+或Tgf/f的小鼠交配获得基因型为Tgf/+；CD8ERT2Cre+的F2代小鼠；将所述F2代小鼠与基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)构建CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA的重组打靶载体；/n(2)将所述重组打靶载体转染到供体小鼠受精卵中，得到转染受精卵；/n(3)将所述转染受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，生产出F0代小鼠；对所述F0代小鼠进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为嵌合体小鼠；/n(4)将所述嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，获得后代小鼠并进行PCR鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为F1代小鼠；/n(5)将所述F1代小鼠与基因型为Tg

【技术特征摘要】
1.一种CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA的重组打靶载体；
(2)将所述重组打靶载体转染到供体小鼠受精卵中，得到转染受精卵；
(3)将所述转染受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，生产出F0代小鼠；对所述F0代小鼠进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为嵌合体小鼠；
(4)将所述嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，获得后代小鼠并进行PCR鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为F1代小鼠；
(5)将所述F1代小鼠与基因型为Tgf/+或Tgf/f的小鼠交配获得F2代小鼠；
(6)将所述F2代小鼠与基因型为Tgf/+或Tgf/f的小鼠相互近交获得F3代小鼠；
(7)对F3代小鼠给予诱导，得到所述小鼠模型。


2.根据权利要求1所述的CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述构建CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA的重组打靶载体，具体操作如下：
通过同源重组的方式将所述2A-CreERT2-Wpre-pA基因在CD8基因终止密码子位点定点敲入2A-CreERT2-Wpre-pA得到CD8-2A-CreERT2-Wpre-pA表达框，进而获得所述CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA的重组打靶载体；
所述重组打靶载体包含2.9kb5’同源臂、2A-CreERT2-Wpre-pA和3.0kb3’同源臂。


3.根据权利要求1所述的CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA的小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，与所述重组打靶载体同时转染到小鼠受精卵中的还有Cas9mRNA和gRNA，所述gRNA序列如SEQIDNO:1所示。


4.根据权利要求1所述的CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA的小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述供体小鼠为C57BL/6J小鼠；步骤(3)中，所述假孕母鼠为C57BL/6J小鼠。


5.根据权利要求1所述的CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晶，孙娜，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32