大鼠基因组的靶向修饰制造技术

提供用于使用如本文所述的包含各种内源性或外源性核酸序列的大靶向载体(LTVEC)来修饰目标大鼠基因组基因座的组合物和方法。也提供用于产生在它们的种系中包含一种或多种靶向遗传修饰的经遗传修饰的大鼠的组合物和方法。提供包括经遗传修饰的大鼠或大鼠细胞的组合物和方法，所述经遗传修饰的大鼠或大鼠细胞在大鼠白介素‑2受体γ基因座、大鼠ApoE基因座、大鼠Rag2基因座、大鼠Rag1基因座和/或大鼠Rag2/Rag1基因座中包含靶向遗传修饰。本文提供的各种方法和组合物允许这些经修饰的基因座通过种系传递。

【技术实现步骤摘要】
大鼠基因组的靶向修饰分案申请说明本申请是申请日为2014年04月16日，申请号为201480033094.0，专利技术名称为“大鼠基因组的靶向修饰”的专利技术专利申请的分案申请。通过EFS网以文本文件形式提交的序列表的引用序列表的正式文本通过EFS网以文件名为444701SEQLIST.TXT，于2014年4月16日创建，并且具有15千字节大小的ASCII格式的序列表形式电子提交，并且与说明书一同提交。这个ASCII格式的文件中含有的序列表是说明书的一部分，并且以引用的方式整体并入本文。专利
能够在一次或多次连续体外遗传修饰之后维持多能性，并且能够通过种系向后代传递靶向遗传修饰的分离的非人全能或多能干细胞，特别是大鼠胚胎干细胞。用于经由原核细胞中的细菌同源重组(BHR)来修饰目标大鼠基因组基因座的组合物和方法。用于使用与核酸内切酶组合的大靶向载体(LTVEC)来遗传修饰目标大鼠基因组基因座的组合物和方法。用于产生包含一种或多种靶向遗传修饰的经遗传修饰的大鼠的组合物和方法。专利技术背景尽管大鼠已被认为是一种可重演各种人类疾病(包括但不限于心血管疾病(例如高血压)、代谢疾病(例如肥胖症、糖尿病)、神经疾病(例如疼痛病变)和多种癌症)的病理学的重要动物模型系统，但相较于小鼠，大鼠在人疾病建模方面的使用受到限制，这部分是由于可在一系列体外遗传修饰(例如一次或多次连续电穿孔)之后维持它们多能性的种系可传递多能大鼠细胞的不可用性，并且部分是由于缺乏允许在多能大鼠细胞中引入或缺失大基因组DNA序列，或用外源性核酸序列替换大内源性基因组DNA序列的高效靶向技术。本领域中需要允许在大鼠的基因组中实现精确靶向改变的组合物和方法，此可展开或扩展当前靶标发现领域，并且更快速和容易地验证治疗剂。概述提供用于通过靶向遗传修饰来修饰多能细胞中的目标基因组基因座的方法。所述方法包括(a)向多能细胞中引入包含侧接有5’同源臂和3’同源臂的插入核酸的大靶向载体(LTVEC)；以及(b)鉴定在目标基因组基因座处包含靶向遗传修饰的遗传修饰的多能细胞，其中靶向遗传修饰能够通过种系传递。在一个实施方案中，多能细胞源于非人动物(包括但不限于啮齿动物)、人、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如狨猿、恒河猴)、驯化哺乳动物或农业哺乳动物或任何其它目标生物体。在一个实施方案中，多能细胞是非人多能细胞。在一个实施方案中，非人多能细胞是哺乳动物多能细胞。在一个实施方案中，哺乳动物多能细胞是啮齿动物多能细胞。在一个实施方案中，啮齿动物多能细胞是大鼠或小鼠多能细胞。在一个实施方案中，多能细胞是人诱导多能干(iPS)细胞。在一个实施方案中，多能细胞是处于单细胞阶段的非人受精卵。在一个实施方案中，非人受精卵是哺乳动物受精卵。在一个实施方案中，哺乳动物受精卵是处于单细胞阶段的啮齿动物受精卵。在一个实施方案中，哺乳动物受精卵是处于单细胞阶段的大鼠或小鼠受精卵。在一些实施方案中，LTVEC的5’同源臂和3’同源臂的总和是至少10kb。在一些实施方案中，LTVEC的5’同源臂和3’同源臂的总和是至少10kb但小于100kb，或LTVEC的5’同源臂和3’同源臂的总和是至少10kb但小于150kb。在其它实施方案中，LTVEC的5'同源臂和3'同源臂的总体的总和大小是约10kb至约150kb、约10kb至约100kb、约10kb至约75kb、约20kb至约150kb、约20kb至约100kb、约20kb至约75kb、约30kb至约150kb、约30kb至约100kb、约30kb至约75kb、约40kb至约150kb、约40kb至约100kb、约40kb至约75kb、约50kb至约150kb、约50kb至约100kb、或约50kb至约75kb、约10kb至约30kb、约20kb至约40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、约80kb至约100kb、约100kb至约120kb、或约120kb至约150kb。在一个实施方案中，缺失的大小与LTVEC的5'同源臂和3'同源臂的总和大小相同或类似。在一些所述实施方案中，靶向遗传修饰是双等位基因修饰。在一些实施方案中，多能细胞是多能大鼠细胞。在一个实施方案中，多能大鼠细胞是大鼠胚胎干细胞。在一个实施方案中，多能大鼠细胞源于DA品系或ACI品系。在一些实施方案中，多能大鼠细胞的特征在于表达至少一种包括以下的多能性标志物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1或其组合。在一些所述方法中，多能大鼠细胞的特征在于以下特征中的一个或多个：(a)缺乏一种或多种包括c-Myc、Ecat1和/或Rexo1的多能性标志物的表达；(b)缺乏包括Brachyury和/或Bmpr2的中胚层标志物的表达；(c)缺乏一种或多种包括Gata6、Sox17和/或Sox7的内胚层标志物的表达；或(d)缺乏一种或多种包括巢蛋白(Nestin)和/或Pax6的神经标志物的表达。所述方法规定LTVEC的5’同源臂和3’同源臂的总和是约10kb至约30kb、约20kb至约40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、或约80kb至约100kb、约100kb至约120kb、约120kb至约150kb、或约10kb但小于约150kb。在一些实施方案中，LTVEC的5’同源臂和3’同源臂的总和是约16Kb至约100Kb。在其它实施方案中，LTVEC的5'同源臂和3'同源臂的总体的总和大小是约10kb至约150kb、约10kb至约100kb、约10kb至约75kb、约20kb至约150kb、约20kb至约100kb、约20kb至约75kb、约30kb至约150kb、约30kb至约100kb、约30kb至约75kb、约40kb至约150kb、约40kb至约100kb、约40kb至约75kb、约50kb至约150kb、约50kb至约100kb、约50kb至约75kb、约10kb至约30kb、约20kb至约40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、约80kb至约100kb、约100kb至约120kb、或约120kb至约150kb。在一个实施方案中，缺失的大小与LTVEC的5'同源臂和3'同源臂的总和大小相同或类似。方法进一步规定靶向遗传修饰(a)包括用同源或直系同源哺乳动物核酸序列替换内源性大鼠核酸序列；(b)包括缺失内源性大鼠核酸序列；(c)包括缺失内源性大鼠核酸序列，其中所述缺失在约5kb至约10kb、约10kb至约20kb、约20kb至约40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、约80kb至约100kb、约100kb至约150kb、或约150kb至约200kb、约200kb至约300kb、约300kb至约400kb、约400kb至约500kb、约500kb至约1Mb、约1Mb至约1.5Mb、约1.5Mb本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于靶向修饰多能大鼠细胞中的目标基因组基因座的方法，其包括/n(a)向所述多能大鼠细胞中引入包含侧接有5’大鼠同源臂和3’大鼠同源臂的插入核酸的大靶向载体(LTVEC)，其中所述5’同源臂和所述3’同源臂的总和是至少10kb但小于150kb；以及/n(b)鉴定在所述目标基因组基因座处包含所述靶向遗传修饰的经遗传修饰的多能大鼠细胞，/n其中所述靶向遗传修饰能够通过种系传递。/n

【技术特征摘要】
20130416 US 61/812,319;20131211 US 61/914,7681.一种用于靶向修饰多能大鼠细胞中的目标基因组基因座的方法，其包括
(a)向所述多能大鼠细胞中引入包含侧接有5’大鼠同源臂和3’大鼠同源臂的插入核酸的大靶向载体(LTVEC)，其中所述5’同源臂和所述3’同源臂的总和是至少10kb但小于150kb；以及
(b)鉴定在所述目标基因组基因座处包含所述靶向遗传修饰的经遗传修饰的多能大鼠细胞，
其中所述靶向遗传修饰能够通过种系传递。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述靶向遗传修饰是双等位基因修饰。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多能大鼠细胞是大鼠胚胎干(ES)细胞。


4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述多能大鼠细胞源于DA品系或ACI品系。


5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多能大鼠细胞的特征在于表达至少一种包括以下的多能性标志物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1或其组合。


6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多能大鼠细胞的特征在于以下特征中的一个或多个：
(a)缺乏一种或多种包括c-Myc、Ecat1和/或Rexo1的多能性标志物的表达；
(b)缺乏包括Brachyury和/或Bmpr2的中胚层标志物的表达；
(c)缺乏一种或多种包括Gata6、Sox17和/或Sox7的内胚层标志物的表达；或
(d)缺乏一种或多种包括巢蛋白和/或Pax6的神经标志物的表达。


7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述LTVEC的所述5’同源臂和所述3’同源臂的总和是约10kb至约30kb、约20kb至约40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、约80kb至约100kb、约100kb至约120kb、或约120kb至150kb。


8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述LTVEC的所述5’同源臂和所述3’同源臂的总和是约16Kb至约150Kb。


9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述靶向遗传修饰包括：
(a)用同源或直系同源核酸序列替换内源性大鼠核酸序列；
(b)缺失内源性大鼠核酸序列；
(c)缺失内源性大鼠核酸序列，
其中所述缺失在约5kb至约10kb、约10kb至约20kb、约20kb至约40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、约80kb至约100kb、约100kb至约150kb、或约150kb至约200kb、约200kb至约300kb、约300kb至约400kb、约400kb至约500kb、约500kb至约1Mb、约1Mb至约1.5Mb、约1.5Mb至约2Mb、约2Mb至约2.5Mb、或约2.5Mb至约3Mb的范围内；
(d)在约5kb至约10kb、约10kb至约20kb、约20kb至约40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、约80kb至约100kb、约100kb至约150kb、约150kb至约200kb、约200kb至约250kb、约250kb至约300kb、约300kb至约350kb、或约350kb至约400kb的范围内的外源性核酸序列；
(e)包含同源或直系同源核酸序列的外源性核酸序列；
(f)包含人和大鼠核酸序列的嵌合核酸序列；
(g)侧接有位点特异性重组酶靶序列的条件性等位基因；或，
(h)可操作地连接至在大鼠细胞中具有活性的启动子的报告基因。


10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述目标基因组基因座包含(i)与所述5’大鼠同源臂互补的的第一核酸序列；和(ii)与所述3’大鼠同源臂互补的第二核酸序列。


11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列相隔至少5kb但小于3Mb。


12.如权利要求10所述的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列相隔至少5kb但小于10kb、至少10kb但小于20kb、至少20kb但小于40kb、至少40kb但小于60kb、至少60kb但小于80kb、至少约80kb但小于100kb、至少100kb但小于150kb、或至少150kb但小于200kb、至少约200kb但小于约300kb、至少约300kb但小于约400kb、至少约400kb但小于约500kb、至少约500kb但小于约1Mb、至少约1Mb但小于约1.5Mb、至少约1.5Mb但小于约2Mb、至少约2Mb但小于约2.5Mb、或至少约2.5Mb但小于约3Mb。


13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中引入步骤(a)进一步包括引入编码促进所述靶向构建体与所述多能大鼠细胞中的所述目标基因组基因座之间的同源重组的核酸酶试剂的第二核酸。


14.如权利要求13所述的方法，其中所述核酸酶试剂包括
(a)包含融合于FokI核酸内切酶的基于锌指的DNA结合结构域的嵌合蛋白；或，
(b)包含融合于FokI核酸内切酶的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)的嵌合蛋白。


15.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中引入步骤(a)进一步包括向所述多能大鼠细胞中引入：
(i)包含可操作地连接至编码成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白的第一核酸序列的第一启动子的第一表达构建体，
(ii)包含可操作地连接至基因组靶序列的第二启动子的第二表达构建体，所述基因组靶序列连接至导向RNA(gRNA)，
其中所述基因组靶序列通过前间区序列邻近基序(PAM)序列以紧邻方式侧接在所述3’末端上。


16.如权利要求15所述的方法，其中所述目标基因组基因座包含核苷酸序列SEQIDNO:1。


17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述gRNA包含编码成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式活化CRISPRRNA(tracrRNA)的第三核酸序列。


18.如权利要求15、16或17所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9。


19.如权利要求15、16、17或18所述的方法，其中所述gRNA包括：
(a)具有核酸序列SEQIDNO:2的嵌合RNA；或，
(b)具有核酸序列SEQIDNO:3的嵌合RNA。


20.如权利要求17所述的方法，其中所述crRNA包含SEQIDNO:4；SEQIDNO:5；或SEQIDNO:6。


21.如权利要求17所述的方法，其中所述tracrRNA包含SEQIDNO:7或SEQIDNO:8。


22.一种经修饰的大鼠基因组基因座，其包含：
(i)同源或直系同源人核酸序列的插入；
(ii)内源性大鼠核酸序列被所述同源或直系同源人核酸序列的替换；或
(iii)其组合，
其中所述经修饰的大鼠基因组基因座能够通过种系传递。


23.如权利要求22所述的经修饰的大鼠基因组基因座，其中所述插入或替换的大小是约5kb至约400kb。


24.如权利要求22所述的大鼠基因组基因座，其中所述插入或替换的大小是约5kb至约10kb、约10kb至约20kb、约20kb至约40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、约80kb至约100kb、约100kb至约150kb、约150kb至约200kb、约200kb至约250kb、约250kb至约300kb、约300kb至约350kb、或约350kb至约400kb。


25.一种用于制备人源化大鼠的方法，其包括：
(a)用包含人核酸的靶向构建体靶向多能大鼠细胞中的目标基因组基因座以形成经遗传修饰的多能大鼠细胞；
(b)向宿主大鼠胚胎中引入所述经遗传修饰的多能大鼠细胞；以及
(c)在代孕母体中孕育所述宿主大鼠胚胎；其中所述代孕母体产生包含经修饰的基因组基因座的大鼠子代，所述经修饰的基因组基因座包含：
(i)人核酸序列的插入；
(ii)在所述目标基因组基因座处的所述大鼠核酸序列被同源或直系同源人核酸序列的替换；
(iii)包含人和大鼠核酸序列的嵌合核酸序列；或
(iv)其组合，
其中所述经修饰的基因组基因座能够通过种系传递。


26.如权利要求25所述的方法，其中所述靶向构建体是大靶向载体(LTVEC)，并且所述LTVEC的所述5’同源臂和所述3’同源臂的总和是至少10kb但小于150kb。


27.如权利要求26所述的方法，其中所述靶向构建体的所述5’同源臂和所述3’同源臂的总和是约10kb至约30kb、约20kb至40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、或约80kb至约100kb、约100kb至约120kb、或约120kb至150kb。


28.如权利要求25、26或27所述的方法，其中所述人核酸序列是至少5kb但小于400kb。


29.如权利要求25、26或27所述的方法，其中所述人核酸序列是至少5kb但小于10kb、至少10kb但小于20kb、至少20kb但小于40kb、至少40kb但小于60kb、至少60kb但小于80kb、至少约80kb但小于100kb、至少100kb但小于150kb、至少150kb但小于200kb、至少200kb但小于250kb、至少250kb但小于300kb、至少300kb但小于350kb、或至少350kb但小于400kb。


30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中所述多能大鼠细胞是大鼠胚胎干(ES)细胞。


31.如权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述多能大鼠细胞源于DA品系或ACI品系。


32.如权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述多能大鼠细胞的特征在于表达至少一种包括以下的多能性标志物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1或其组合。


33.如权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述多能大鼠细胞的特征在于以下特征中的一个或多个：
(a)缺乏一种或多种包括c-Myc、Ecat1和/或Rexo1的多能性标志物的表达；
(b)缺乏一种或多种包括Brachyury和/或Bmpr2的中胚层标志物的表达；
(c)缺乏一种或多种包括Gata6、Sox17和/或Sox7的内胚层标志物的表达；或
(d)缺乏一种或多种包括巢蛋白和/或Pax6的神经标志物的表达。


34.一种包含人源化基因组基因座的经修饰的大鼠，其中所述人源化基因组基因座包含：
(i)同源或直系同源人核酸序列的插入；
(ii)在内源性基因组基因座处的大鼠核酸序列被同源或直系同源人核酸序列的替换；
(iii)包含人核酸序列和大鼠核酸序列的嵌合核酸序列；或，
(iv)其组合，
其中所述人源化基因组基因座能够通过种系传递。


35.一种在它的基因组基因座中包含靶向遗传修饰的大鼠或大鼠细胞，
其中所述基因组基因座是白介素-2受体γ基因座、ApoE基因座、Rag1基因座、Rag2基因座、或Rag2/Rag1基因座，
其中所述靶向遗传修饰包括：
(a)缺失所述基因组基因座处的内源性大鼠核酸序列；
(b)插入同源核酸、直系同源核酸或包含人核酸序列和大鼠核酸序列的嵌合核酸，或
(c)其组合，
其中所述靶向遗传修饰可通过所述大鼠或从所述大鼠细胞繁殖的大鼠的种系传递。


36.如权利要求35所述的大鼠或大鼠细胞，其中
(a)在所述基因组基因座处的所述内源性大鼠核酸的所述缺失是至少约10kb；或，
(b)在所述基因组基因座处的所述内源性大鼠核酸的所述缺失是约5kb至约10kb、约10kb至约20kb、约20kb至约40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、约80kb至约100kb、约100kb至约150kb、或约150kb至约200kb、约200kb至约300kb、约300kb至约400kb、约400kb至约500kb、约500kb至约1Mb、约1Mb至约1.5Mb、约1.5Mb至约2Mb、约2Mb至约2.5Mb、或约2.5Mb至约3Mb；
(c)在所述基因组基因座处的所述外源性核酸序列的所述插入是至少约5kb；或，
(d)在所述基因组基因座处的所述外源性核酸序列的所述插入是约5kb至约10kb、约10kb至约20kb、约20kb至约40kb、约40kb至约60kb、约60kb至约80kb、约80kb至约100kb、约100kb至约150kb、约150kb至约200kb、约200kb至约250kb、约250kb至约300kb、约300kb至约350kb、或约350kb至约400kb。


37.如权利要求35或36所述的大鼠或大鼠细胞，其中
(a)在所述白介素-2受体γ基因座处的所述靶向遗传修饰导致白介素-2受体γ蛋白活性降低或不存在；
(b)在所述ApoE基因座处的所述靶向遗传修饰导致ApoE蛋白活性降低或不存在；
(c)在所述Rag1基因座处的所述靶向遗传修饰导致Rag1蛋白活性降低或不存在；
(d)在所述Rag2基因座处的所述靶向遗传修饰导致Rag2蛋白活性降低或不存在；或，
(e)在所述Rag2/Rag1基因座处的所述靶向遗传修饰导致Rag2蛋白活性和Rag1活性降低或不存在。


38.如权利要求35、36或37所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·D·李，A·O·穆希卡，W·奥尔巴克，K·V·莱，D·M·瓦伦泽拉，G·D·扬科普洛斯，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US