一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法技术

本发明专利技术涉及山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量同时测定的方法，尤其涉及一种水解黄酮苷，并经过固相萃取净化，LC‑MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法。一种LC‑MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，该方法包括提取、净化和测定步骤，所述的提取采用盐酸乙醇溶液水解提取法，所述的多种黄酮苷元为槲皮素，木犀草素，山萘酚，芹菜素和黄芩素5种黄酮苷元，在提取时在试样中加入T‑丁基‑1,4‑苯酚作为抗氧化剂。该方法采用在提取时在试样中加入T‑丁基‑1,4‑苯酚作为抗氧化剂，研究发现水解过程中各苷元的损失率低于20%。该方法简便快捷，消耗资源小，检测成本低的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法
本专利技术涉及山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量同时测定的方法，尤其涉及一种水解黄酮苷，并经过固相萃取净化，LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法。
技术介绍
山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.，红腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq,，华南忍冬LoniceraconfusaDC.或黄褐毛忍冬LonicerafulvotomentosaHsuetS.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花，金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花。山银花和金银花均需在夏初花开放前采收获得，具有清热解毒，疏散风热的功效，可用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热。也有研究发现其具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗动脉粥样硬化等作用。原本山银花和金银花并未明确区分，伴随着对药材研究的深入和完善，药材分类越来越严格，在《中国药典》2005年版起，为保护道地药材、规范用药，将山银花和金银花进行了细分。药典中金银花的有效成分为木犀草苷和绿原酸，山银花的有效成分为绿原酸，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙。然而研究表明除了这些成分外，其他黄酮类化合物、挥发油类化合物、有机酸类和三萜类化合物也陆续被发现和鉴别。由于黄酮类化合物种类较多，在植物体内苷元可与糖类物质形式不同的苷而普遍存在，且标准品较难获取，目前除液相色谱-高分辨质谱法分析，其他分析手段较难获得更全面的信息。本申请筛选出山银花和金银花中5种主要的黄酮苷元和对应的黄酮苷(槲皮素，木犀草素，山萘酚，芹菜素，黄芩素，芦丁，木犀草苷，紫云英苷，野漆树苷和黄芩苷)。表1各类化合物的基本信息编号名称英文名称CAS号分子式分子量1槲皮素Quercetin117-39-5C15H10O7302.22木犀草素Luteolin491-70-3C15H10O6286.23山萘酚Kaempferol520-18-3C15H10O6286.24芹菜素Apigenin520-36-5C15H10O5270.25黄芩素Baicalein491-67-8C15H10O5270.26芦丁Rutin153-18-4C27H30O16610.57木犀草苷Cynaroside5373-11-5C21H20O11448.48紫云英苷Astragalin480-10-4C21H20O11448.49野漆树苷Rhoifolin17306-46-6C27H30O14578.510黄芩苷Baicalin21967-41-9C21H18O11446.4中国专利技术专利申请(CN107389814A)公开了一种运用反相高效液相色谱二极管阵列检测快速测定沙棘中儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素成分含量的方法。该方法通过酸性水解，将黄酮苷水解后，释放独立的游离苷元，依靠RP-HPLC-DAD对游离苷元进行准确定量，获得黄酮提取物的精确质控数据。黄酮苷水解方法：采用盐酸作为水解作用剂，甲醇为反应溶剂；反应条件为：以甲醇溶解黄酮提取物，加入盐酸溶液，80-95℃下加热回流0.5-3h。而目前采用盐酸水解法对于黄酮苷元回收率低于30％，无法实现有效的测定。
技术实现思路
为了解决盐酸水解法提取黄酮苷元回收率低的技术问题，本申请的目的是提供一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，该方法采用在提取时在试样中加入T-丁基-1,4-苯酚作为抗氧化剂，研究发现水解过程中各苷元的损失率低于20％。该方法简便快捷，消耗资源小，检测成本低的特点。为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，该方法包括提取、净化和测定步骤，所述的提取采用盐酸乙醇溶液水解提取法，所述的多种黄酮苷元为槲皮素，木犀草素，山萘酚，芹菜素和黄芩素5种黄酮苷元，在提取时在试样中加入T-丁基-1,4-苯酚作为抗氧化剂。作为优选，所述的T-丁基-1,4-苯酚的加入量为试样的质量的0.8-2倍。作为优选，所述的提取水解条件为：加T-丁基-1,4-苯酚，50VOL％的乙醇溶液和浓盐酸，在氮气保护下，水浴加热回流120min。作为一个具体的实施方式，所述的提取如下：称取0.5g试样，精确到0.01g，置于150mL圆底烧瓶中，加0.5gT-丁基-1,4-苯酚，36mL50VOL％的乙醇溶液和4.0mL浓盐酸，在氮气保护下，水浴加热回流120min，氮气保护下冷却后，加水定容至50mL。作为优选，所述的净化采用HLB固相萃取柱。作为一个具体的实施方式，所述的净化步骤如下：取上清液1mL，加入9mL水，混匀并转移至HLB固相萃取柱中，HLB固相萃取柱依次用5mL甲醇和5mL5VOL％甲醇溶液活化，加入5mL10％甲醇溶液淋洗，抽干，加10mL甲醇进行洗脱，控制流速1mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液，定容至10mL，摇匀，过0.22μm有机滤膜，取1.0mL定容溶液，加40％的甲醇溶液稀释定容至25mL。作为一个具体的实施方式，所述的测定采用液相色谱-串联质谱法对黄酮苷元进行定量测定，包括以下步骤：①标准工作液和样品溶液在设定的液相色谱串联质谱条件下进样，以百分比浓度X为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，外标法定量的化合物以峰面积为纵坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中各化合物的响应值应在仪器检测的线性范围内；②在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的化合物在设定的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的混合基质标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则可确定含有该化合物。作为一个具体的实施方式，所述的色谱柱具体参数如下：色谱柱:MightysilRP-18，3μm，4.6×150mm；流动相:A甲醇-B0.15％甲酸溶液；<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，该方法包括提取、净化和测定步骤，所述的提取采用盐酸乙醇溶液水解提取法，其特征在于，所述的多种黄酮苷元为槲皮素，木犀草素，山萘酚，芹菜素和黄芩素5种黄酮苷元，在提取时在试样中加入T-丁基-1,4-苯酚作为抗氧化剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，该方法包括提取、净化和测定步骤，所述的提取采用盐酸乙醇溶液水解提取法，其特征在于，所述的多种黄酮苷元为槲皮素，木犀草素，山萘酚，芹菜素和黄芩素5种黄酮苷元，在提取时在试样中加入T-丁基-1,4-苯酚作为抗氧化剂。


2.根据权利要求1所述的一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，其特征在于，T-丁基-1,4-苯酚的加入量为试样的质量的0.8-2倍。


3.根据权利要求2所述的一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，其特征在于，提取水解条件为：加T-丁基-1,4-苯酚，50VOL％的乙醇溶液和浓盐酸，在氮气保护下，水浴加热回流120min。


4.根据权利要求3所述的一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，其特征在于，提取如下：称取0.5g试样，精确到0.01g，置于150mL圆底烧瓶中，加0.5gT-丁基-1,4-苯酚，36mL50VOL％的乙醇溶液和4.0mL浓盐酸，在氮气保护下，水浴加热回流120min，氮气保护下冷却后，加水定容至50mL。


5.根据权利要求1所述的一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，其特征在于，净化采用HLB固相萃取柱。


6.根据权利要求5所述的一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，其特征在于，净化步骤如下：取提取后的上清液1mL，加入9mL水，混匀并转移至HLB固相萃取柱中，HLB固相萃取柱依次用5mL甲醇和5mL5VOL％甲醇溶液活化，加入5mL10％甲醇溶液淋洗，抽干，加10mL甲醇进行洗脱，控制流速1mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液，定容至10mL，摇匀，过0.22μm有机滤膜，取1.0mL定容溶液，加40％的甲醇溶液稀释定容至25mL。


7.根据权利要求1-6任意一项权利要求所述的一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，其特征在于，测定采用液相色谱-串联质谱法对黄酮苷元进行定量测定，包括以下步骤：
①标准工作液和样品溶液在设定的液相色谱串联质谱条件下进样，以百分比浓度X为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯建波，谢文，史颖珠，姚滨滨，陆顺，祝泽龙，张雅琴，
申请(专利权)人：杭州海关技术中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33