海洋水体中生物蝶呤的检测方法技术

本发明专利技术提供一种海洋水体中生物蝶呤的检测方法，包括以下步骤：前处理：水样过滤后弃滤液，取颗粒物并加入细胞裂解液破碎，得到溶出液；调节所述溶出液的pH，萃取后得到含有生物蝶呤的水相；2)用反相高效液相色谱对所述含生物蝶呤的水相进行检测；其中，反相高效液相色谱采用等度洗脱，流动相为甲醇和水。本发明专利技术实施例所提供的海洋水体中生物蝶呤含量的检测方法通过特定条件的前处理，有效提升检测灵敏度，使检测限进一步缩小，能够适应海洋水体含量较低的现状，具有较高的精准性，对于揭示生物蝶呤在海洋浮游生物中尤其是微型生物生命活动的调控过程、加强对海洋化学的理解具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
海洋水体中生物蝶呤的检测方法
本专利技术涉及生物检测
，尤其是涉及一种海洋水体中生物蝶呤的检测方法。
技术介绍
生物蝶呤(Biopterin，BTP)是三磷酸鸟苷(GTP)代谢产物，控制GTP转化成蝶呤的GTP环水解酶I在原核生物和真核生物中均有发现。自然界中，从细菌到高等动植物(除昆虫外)均可合成生物蝶呤。生物蝶呤作为70多种酶类的内源性辅酶因子，参与动植物、细菌和真菌的生命活动过程。生物蝶呤是包括固氮酶类、一氧化氮合成酶、硝酸盐还原酶、亚硫酸氧化酶、一氧化碳氧化还原酶、苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、色氨酸羟化酶以及叶酸、维生素等合成代谢过程的必需辅酶因子，具有重要的生理功能，在海洋碳氮循环中至关重要。医学研究发现，生物蝶呤在生物体内一系列生理和病理过程中起关键作用。还原性生物蝶呤在哺乳类动物中起芳香族氨基酸的辅基作用，此外在人体中还具有抗氧化和清除活性氮氧化物的功能。与生物蝶呤在医学上趋于成熟的研究相比，海洋生物，特别是海洋浮游生物中有关生物蝶呤定量的研究目前在国际上尚未见诸报道。此前研究发现生物蝶呤-α-葡糖苷在蓝藻生长过程中抵御紫外辐射的危害效果显著，为了揭示生物蝶呤在海洋浮游生物中的生命活动的调控过程，加强对海洋化学的理解，有必要提供一种针对海洋水体中微型生物的生物蝶呤的检测方法，而目前的困难之一在于海洋水体中的生物蝶呤含量极低，常规的检测方法难以使用。根据现今存在的问题，提出一种海洋水体中生物蝶呤含量的检测方法成为亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种海洋水体中生物蝶呤的检测方法。第一方面，本专利技术的一个实施例提供了一种海洋水体中生物蝶呤的检测方法，包括以下步骤：1)前处理：水样过滤后弃滤液，取颗粒物并加入细胞裂解液破碎，得到溶出液；调节所述溶出液的pH，萃取后得到含有生物蝶呤的水相；2)用反相高效液相色谱对含有生物蝶呤的水相进行检测；其中，反相高效液相色谱采用等度洗脱，流动相为甲醇和水。本专利技术实施例的海洋水体中生物蝶呤含量的检测方法至少具有如下有益效果：本专利技术实施例开发建立了一种针对性的生物蝶呤测定方法，通过特定条件的前处理，有效提升检测灵敏度，使检测限进一步缩小，能够适应海洋水体含量较低的现状，具有较高的精准性，同时结合高通量的反相高效液相色谱有利于获得真实、准确的数据，对于揭示生物蝶呤在海洋浮游生物中尤其是微型生物生命活动的调控过程、加强对海洋化学的理解具有重要意义。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，基于流动相的总体积，甲醇的体积为5％至15％，水的体积为85％至95％。通过特定比例范围条件的流动相设置，使得流动相系统粘度较小，过柱时具有更好的柱效，样品中的生物蝶呤具有更高的分离效率。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，流动相中甲醇和水的体积比为10：90。依此比例设置的流动相能够进一步提高检测灵敏度和精度。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，等度洗脱时，色谱柱柱温为25℃至30℃，流动相的流速为0.6mL/min至0.8mL/min。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，等度洗脱时，流动相的流速为0.7mL/min。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，检测时设置激发波长为275～285nm，发射波长为442～446nm。通过对激发波长和发射波长的调整设置能够采集到更强的信号从而提高检测精度。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，检测时设置激发波长为280nm，发射波长为444nm。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，色谱柱为C18反相键合硅胶柱。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，前处理过程中调节溶出液的pH为6-7。通过对溶出液pH的调节限定，使得检测过程中生物蝶呤具有更高的提取效率。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤含量的检测方法，还包括以下步骤：3)液相色谱-质谱联用：液质联用获得生物蝶呤的质谱信息。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，液相色谱-质谱联用进行质谱分析时，离子源为电喷雾离子源，扫描模式为负离子模式，毛细管电压为3KV至5KV，雾化气压力40psi至50psi，干燥气温度为300℃至400℃，干燥气流速为10L/min至12L/min，扫描范围为50m/z至300m/z。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，液相色谱-质谱联用进行质谱分析时，选择192和147作为生物蝶呤的定量子离子进行分析。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，前处理时过滤用的滤膜的孔径为0.2μm至0.3μm。以该孔径进行过滤保证海洋水体中微型生物都能够予以保留，提高生物蝶呤含量检测的准确度。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，滤膜为聚碳酸酯膜。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，等度洗脱时进样量为30μL至50μL。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，在进行等度洗脱时，间歇性冲洗色谱柱。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，细胞裂解液可以使用本领域所熟知的具有裂解功能的细胞裂解液配方。优选地，细胞裂解液的组分为5％甲醇，95％色谱级纯水，使用盐酸调节pH为3到4，更进一步将其pH调节为3.5。通过该配方的细胞裂解液，使得海洋水体中微型生物的细胞都能够最大程度的破壁，使得内容物流出以进行检测。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，加入有机溶剂进行萃取除去有机物时，可以使用本领域所熟知的任意有机萃取剂，例如，氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷等。通过萃取分离其中的脂类化合物。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，在得到含生物蝶呤的水相后，需要进一步过滤从而进行反相高效液相色谱。根据本专利技术的一些实施例的海洋水体中生物蝶呤的检测方法，液相进样盘的温度为2-6℃。本专利技术方法灵敏性好、测定精度高、检出限低(1.86ng/L)，可实现大批量样品的处理检测，优化的色谱方法提高了数据测定质量，特别适用于自然水环境中微型生物样本中生物蝶呤的测定需求。附图说明图1为本专利技术的一个实施例的生物蝶呤检测方法的流程图。图2为本专利技术的一个实施例根据生物蝶呤标准品经反向高效液相色谱结果。图3是本专利技术的一个实施例中液质联用的质谱图。图4是本专利技术的一个实施例中液质联用的质谱优化图。图5是本专利技术的另一个实施例的条件优化实验中样品不同pH条件下对不同浓度样品的检测结果。图6是本专利技术的另一个实施例的条件优化实验中样品不同pH条件下不同浓度样品的回收率结果。图7是本专利技术的另一个实施例的条件优化实验中流动相不同甲醇-水比例下样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海洋水体中生物蝶呤的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)前处理：水样过滤后弃滤液，取颗粒物并加入细胞裂解液破碎，得到溶出液；调节所述溶出液的pH，萃取后得到含有生物蝶呤的水相；/n2)用反相高效液相色谱对所述含有生物蝶呤的水相进行检测；/n其中，反相高效液相色谱采用等度洗脱，流动相为甲醇和水。/n

【技术特征摘要】
1.一种海洋水体中生物蝶呤的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)前处理：水样过滤后弃滤液，取颗粒物并加入细胞裂解液破碎，得到溶出液；调节所述溶出液的pH，萃取后得到含有生物蝶呤的水相；
2)用反相高效液相色谱对所述含有生物蝶呤的水相进行检测；
其中，反相高效液相色谱采用等度洗脱，流动相为甲醇和水。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，基于流动相的总体积，甲醇的体积为5％至15％，水的体积为85％至95％。


3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，色谱柱的柱温为25℃至30℃，所述流动相的流速为0.6mL/min至0.8mL/min。


4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，反相高效液相色谱检测时，激发波长为275nm至285nm，发射波长为442nm至446nm。


5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，色谱柱为C18反相键合硅胶柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅康，石梦秋，王德利，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35