一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法技术

本申请属于病毒蛋白检测技术领域，具体涉及一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法。本发明专利技术提供了一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法，包括以下步骤：1)将体外表达的病毒蛋白样本溶于盐酸中，震荡混匀；2)超声处理；3)向超声后的样品中加入与步骤1)等体积的盐酸，震荡混匀；4)孵育；5)将孵育后的样品超声，然后在12000‑15000rpm离心5‑10分钟；6)取上清液置于超滤管中真空抽滤，将滤液冻干后进行检测；7)将检测结果与数据库进行比对得蛋白鉴定结果。本方法通过胃蛋白酶和buffer搭配，达到了灭活和酶解的效果。通过蛋白质水平进行病毒鉴定，样本量极其少，避免大量培养和繁殖细胞，极大降低了病毒感染给科研人员的风险，而且节约了培养细胞的时间和成本。

【技术实现步骤摘要】
一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法
本申请属于病毒蛋白检测
，具体涉及一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法。
技术介绍
通过质谱对生物系统中蛋白进行定性定量，已经成为一种主流的分析工具。基于质谱的蛋白组研究通常依赖于蛋白被消化成肽段，然后进行后续的定性定量分析。因此蛋白的酶解对于后续质谱实验至关重要，也是最耗时的一个实验。质谱的结果与样本类型，裂解条件，酶解消化和分馏方法等等密切相关。实验室最常见的溶液酶切手段是FASP(filter-aidedsamplepreparation)，当然还有最传统的In-solution(溶液内)酶切的方法。每一种酶切方法各有优劣，in-solution法比较费时，成本相对小，但是鉴定蛋白数目少且重复性较差。FASP方法虽然十分高效，但是实验步骤较多，需要较长时间，并且还需要承担过滤的费用成本，且不同的裂解配方(SDS和8M尿素)所鉴定的蛋白不同。最后，这两种方法都是针对大量蛋白，利用胰蛋白酶的酶解的方法。而针对微量蛋白的酶解和质谱鉴定，目前没有一个比较快速且高效的方法。针对目前对微量蛋白样品，特别是病毒量级的蛋白样品的检测和鉴定，没有一个比较完善的方法，兼顾样品本身的生物学特性和质量、体积极微量的特点。FASP和in-solution的酶解只适用于大量蛋白的酶解，且花费时间较长。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法，包括以下步骤：1)将体外表达的病毒蛋白样本溶于盐酸中，震荡混匀；2)超声处理；3)向超声后的样品中加入与步骤1)等体积的盐酸，震荡混匀；4)孵育；5)将孵育后的样品超声，然后在12000-15000rpm离心5-10分钟；6)取上清液置于超滤管中真空抽滤，将滤液冻干后进行检测；7)将检测结果与数据库进行比对得蛋白鉴定结果，其中，所述步骤1)中，盐酸中含0.01-0.03mg/mL胃蛋白酶。作为一种优选的技术方案，步骤1)中病毒蛋白样本与盐酸的比例为1：(190-210)pg/μL。作为一种优选的技术方案，所述盐酸的浓度为18-22mM。作为一种优选的技术方案，步骤2)中超声2-4次，每次8-12秒。作为一种优选的技术方案，步骤2)中超声3次，每次10秒。作为一种优选的技术方案，所述步骤3)中的盐酸浓度和步骤1)中相同。作为一种优选的技术方案，在37℃培养箱或金属浴孵育1小时。作为一种优选的技术方案，步骤5)中将孵育后的样品超声8-12s，然后在12000-15000rpm离心5-10分钟。作为一种优选的技术方案，在14000rpm离心5-10分钟。作为一种优选的技术方案，步骤6)中取上清液置于10kd超滤管中真空抽滤，将滤液冻干后进行LC-MS/MS检测。有益效果：本方法通过特殊的蛋白酶和buffer的搭配，达到了同时灭活和酶解的效果。通过蛋白质水平进行病毒的鉴定，我们选取的1pg病毒蛋白样本，相当于实际感染病毒的细胞500-1000个，样本的量极其少，避免大量培养和繁殖细胞，极大的降低了病毒感染给科研人员的风险，而且节约了培养细胞的时间和成本。附图说明图1为AIKLDDKDPNFK肽段的质谱二级图谱。图2为DAALALLLLDRL肽段的质谱二级图谱。图3为IIWVATEGALNT肽段的质谱二级图谱。图4为TVTKKSAA肽段的质谱二级图谱。图5为AIVLQLPQ肽段的质谱二级图谱。具体实施方式为了解决上述问题，本专利技术提供了第一个方面提供了一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法，包括以下步骤：1)将体外表达的病毒蛋白样本溶于盐酸中，震荡混匀；2)超声处理；3)向超声后的样品中加入与步骤1)等体积的盐酸，震荡混匀；4)孵育；5)将孵育后的样品超声，然后在12000-15000rpm离心5-10分钟；6)取上清液置于超滤管中真空抽滤，将滤液冻干后进行检测；7)将检测结果与数据库进行比对得蛋白鉴定结果。步骤1)作为一种优选的实施方式，步骤1)中病毒蛋白样本与盐酸的比例为1：(190-210)pg/μL；优选的，病毒蛋白样本与盐酸的比例为1：200pg/μL。所述盐酸的浓度为18-22mM；优选的，盐酸的浓度为20mM；更优选的，所述盐酸中含0.01-0.03mg/mL胃蛋白酶。本申请中，所述病毒蛋白无特别限制；优选的所述病毒为冠状病毒，所述病毒蛋白为新型冠状病毒2019-nCov的N蛋白。冠状病毒属于冠状病毒科，是自然界广泛存在、能够感染人和动物的一大类病毒家族，在电镜下观察其病毒粒子表面有类似日冕状的纤突而被命名。冠状病毒的基因组较大，其单股正链基因序列长达26-32kb，是己知自然界序列最长的RNA病毒。本申请通过加入20mM的盐酸(含0.02mg/ml胃蛋白酶)，在病毒检测中，能使病毒的外壳蛋白变性，达到灭活病毒的效果，同时不影响胃蛋白酶的工作。步骤2)作为一种优选的实施方式，步骤2)中超声2-4次，每次8-12秒；优选的，超声3次，每次10秒。通过三次超声使得变性的病毒蛋白断裂成大片段。所述超声功率为本领域常用的功率，为300-400W。步骤3)作为一种优选的实施方式，所述步骤3)中的盐酸浓度和步骤1)中相同，所述盐酸中含0.01-0.03mg/mL胃蛋白酶。本申请中，向超声后的样品中加入盐酸震荡混匀后可以室温保存也可以运输24小时，不会影响后续的检测结果。步骤4)本申请中，所述孵育条件不做特别限制，优选的在37℃培养箱或金属浴孵育1小时。步骤5)作为一种优选的实施方式，步骤5)中将孵育后的样品超声8-12s，然后在12000-15000rpm离心5-10分钟；优选的，将孵育后的样品超声10s，在14000rpm离心5-10分钟。本申请将孵育后的样品超声10秒钟让酶解不完全的大片段进一步破碎成小的肽段，若时间超过10秒，胃蛋白酶会破碎，在超滤时穿流，影响病毒蛋白的鉴定。步骤6)作为一种优选的实施方式，步骤6)中取上清液置于10kd超滤管中真空抽滤，将滤液冻干后进行LC-MS/MS检测，其中：buffer为体积分数为0.1％的三氟乙酸。其中，LC-MS/MS测试条件为：高效液相色谱A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱0.15mm*150mm(RP-C18)(ColumnTechnologyInc.)以95％的A相平衡。样品由自动进样器上样到Zorbax300SB-C18peptidetraps(AgilentTechnologies，Wilmington，DE)，再经色谱柱分离。检测液经毛细管高效液相色谱脱盐及分离后用Q-Exactive质谱仪(ThermoFisher,SanJose,CA)进行质谱分析。检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将体外表达的病毒蛋白样本溶于盐酸中，震荡混匀；2)超声处理；3)向超声后的样品中加入与步骤1)等体积的盐酸，震荡混匀；4)孵育；5)将孵育后的样品超声，然后在12000-15000rpm离心5-10分钟；6)取上清液置于超滤管中真空抽滤，将滤液冻干后进行检测；7)将检测结果与数据库进行比对得蛋白鉴定结果，其中，所述步骤1)中，盐酸中含0.01-0.03mg/mL胃蛋白酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种病毒蛋白的快速酶解与检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将体外表达的病毒蛋白样本溶于盐酸中，震荡混匀；2)超声处理；3)向超声后的样品中加入与步骤1)等体积的盐酸，震荡混匀；4)孵育；5)将孵育后的样品超声，然后在12000-15000rpm离心5-10分钟；6)取上清液置于超滤管中真空抽滤，将滤液冻干后进行检测；7)将检测结果与数据库进行比对得蛋白鉴定结果，其中，所述步骤1)中，盐酸中含0.01-0.03mg/mL胃蛋白酶。


2.如权利要求1所述的病毒蛋白的快速酶解与检测方法，其特征在于，步骤1)中病毒蛋白样本与盐酸的比例为1：(190-210)pg/μL。


3.如权利要求1或2所述的病毒蛋白的快速酶解与检测方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为18-22mM。


4.如权利要求1或3所述的病毒蛋白的快速酶解与检测方法，其特征在于，步骤2)中超声2-4次，每次8-12秒...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡金波，王静，邓林涛，
申请(专利权)人：上海元金生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31