本发明专利技术涉及葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,尤其涉及一种水解黄酮苷,并经过固相萃取净化,液相色谱‑串联质谱法同时测定葛根中11种黄酮苷元含量的方法。一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,该方法包括提取、净化和测定步骤,提取采用盐酸乙醇溶液水解提取法,在提取时在试样中加入T‑丁基‑1,4‑苯酚作为抗氧化剂。该方法采用在提取时在试样中加入T‑丁基‑1,4‑苯酚作为抗氧化剂,研究发现水解过程中各苷元的损失率低于20%。进一步,本申请为了解决葛根中黄酮类化合物全面准确测定的技术问题,本申请提供了一种盐酸水解‑固相萃取净化‑液相色谱‑串联质谱法同时测定葛根中11种黄酮苷元含量的方法,该方法简便快捷,消耗资源小,检测成本低的特点。
【技术实现步骤摘要】
一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法
本专利技术涉及葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,尤其涉及一种水解黄酮苷,并经过固相萃取净化,液相色谱-串联质谱法同时测定葛根中11种黄酮苷元含量的方法。
技术介绍
以野葛(豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根)和粉葛(豆科植物甘葛藤(PuerariathomsoniiBenth.的干燥根)为代表的葛根,具有解肌退热,生津止渴,透疹,升阳止泻,通经活络,解酒毒等功效,因此常用于治疗外感发热头痛、项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、眩晕头痛、中风偏瘫、胸痹心痛和酒毒伤中。2000年葛根正式被国家卫生部批准为药食两用植物,可用于新型中药和功能性保健(食)品中。以葛根素(puerarin)、大豆苷(daidzin)、大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)和染料木苷(genistin)为代表的黄酮类化合物是葛根的重要有效组成部分,其中含量最高的是葛根素,《中国药典》将葛根素的含量作为衡量葛根质量的重要指标。以《中国药典》为基础,目前文献报道对葛根中黄酮类化合物含量测定方法主要分为分光光度法测定总黄酮及葛根素含量,液相色谱法对葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元等化合物含量进行测定与分析,通过液相色谱-串联质谱仪或液相色谱-高分辨质谱仪对黄酮类化合物进行结构分析与筛查检测。由于黄酮类化合物种类较多,在植物体内苷元可与糖类物质形式不同的苷而普遍存在,且很多标准品较难获取,因此目前除液相色谱-高分辨质谱法分析,其他分析手段较难获得更全面的信息。因此对葛根中代表性的黄酮苷(葛根素-6″-O-木糖苷、甘草苷、大豆苷、野黄芩苷、大豆黄苷、芦丁、鸢尾苷、染料木苷、山萘酚-3-O-芸香糖苷、黄芩苷和刺芒柄花苷)进行水解,以苷元的形式检测葛根素、甘草素、大豆素、野黄芩素、大豆黄素、槲皮素、鸢尾黄素、染料木素、山萘酚、黄芩素和刺芒柄花素(表1),更为全面的反应出各苷元所代表的黄酮类化合物的总量,对准确测定黄酮类化合物的含量具有重要意义。表1各类化合物的基本信息中国专利技术专利申请(CN107389814A)公开了一种运用反相高效液相色谱二极管阵列检测快速测定沙棘中儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素成分含量的方法。该方法通过酸性水解,将黄酮苷水解后,释放独立的游离苷元,依靠RP-HPLC-DAD对游离苷元进行准确定量,获得黄酮提取物的精确质控数据。黄酮苷水解方法:采用盐酸作为水解作用剂,甲醇为反应溶剂;反应条件为:以甲醇溶解黄酮提取物,加入盐酸溶液,80-95℃下加热回流0.5-3h。而目前采用盐酸水解法对于黄酮苷元回收率低于30%,无法实现有效的测定。
技术实现思路
为了解决盐酸水解法提取黄酮苷元回收率低的技术问题,本申请的目的是提供一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,该方法采用在提取时在试样中加入T-丁基-1,4-苯酚作为抗氧化剂,研究发现水解过程中各苷元的损失率低于20%。进一步,本申请为了解决葛根中黄酮类化合物全面准确测定的技术问题,本申请提供了一种盐酸水解-固相萃取净化-液相色谱-串联质谱法同时测定葛根中11种黄酮苷元含量的方法,该方法简便快捷,消耗资源小,检测成本低的特点。为了实现上述的目的,本申请采用了以下的技术方案:一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,该方法包括提取、净化和测定步骤,提取采用盐酸乙醇溶液水解提取法,在提取时在试样中加入T-丁基-1,4-苯酚作为抗氧化剂。进一步,所述的T-丁基-1,4-苯酚的加入量为试样的质量的3-10倍。进一步,所述的提取水解条件为:10%盐酸,50VOL%乙醇溶液,T-丁基-1,4-苯酚和氮气保护下,水解120min。作为具体实施方式,所述的提取步骤如下:称取0.1g试样,精确到0.01g,置于150mL圆底烧瓶中,加0.5gT-丁基-1,4-苯酚,36mL50VOL%的乙醇溶液和4.0mL浓盐酸,在氮气保护下,水浴加热回流120min,氮气保护下冷却后,加水定容至50mL。进一步,所述的净化采用HLB固相萃取柱。作为具体实施方式,所述的净化步骤如下:取上述提取上清液1mL,加入9mL水,混匀并转移至HLB固相萃取柱中,依次用5mL甲醇和5mL5VOL%甲醇溶液活化,加入5mL20VOL%甲醇溶液淋洗,抽干,加10mL甲醇进行洗脱,控制流速1mL/min~2mL/min,收集全部洗脱液,定容至10mL,摇匀,过0.22μm有机滤膜,取0.1mL定容溶液,加40VOL%的甲醇溶液稀释定容至10mL。进一步,所述的多种黄酮苷元为葛根素、甘草素、大豆素、野黄芩素、大豆黄素、槲皮素、鸢尾黄素、染料木素、山萘酚、黄芩素和刺芒柄花素中一种或多种。进一步,所述的测定采用液相色谱-串联质谱法对黄酮苷元进行定量测定,包括以下步骤:①标准工作液和样品溶液在设定的液相色谱串联质谱条件下进样,以百分比浓度X为横坐标,峰面积的比值Y为纵坐标,外标法定量的化合物以峰面积为纵坐标,绘制6点标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中各化合物的响应值应在仪器检测的线性范围内;②在上述色谱条件下,判断样品中是否存在相应的被测物,需要满足如下条件:样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致,允许偏差小于±2.5%,该色谱峰所对应的化合物在设定的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的混合基质标准工作液的相对丰度一致,相对丰度偏差不超过设定的规定,则可确定含有该化合物。作为具体实施方式,色谱柱具体参数如下:作为具体实施方式,质谱具体参数如下:其它质谱参数如下表所示:*为定量离子对。本申请由于采用了上述的技术方案,经盐酸乙醇溶液水解葛根中的黄酮苷,并对黄酮苷元进行提取,HLB固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱法检测,外标法定量,实现了对葛根中代表性的黄酮苷元含量的测定。方法定量限(以S/N大于10计)0.10%(即1.0mg/g:葛根素,大豆素和黄芩素)和0.05%(即0.5mg/g:甘草素,野黄芩素,大豆黄素,槲皮素,鸢尾黄素,染料木素,山萘酚和刺芒柄花素)。配制0~2.5%线性工作曲线,线性相关系数大于0.996;在葛根粉末中加入各黄酮苷(相当于水解后相应黄酮苷元含量为0.25%,0.5%和1.0%),进行添加回收实验,采用外标法定量,方法总体平均回收率75.1%-93.8%,相对标准偏差:3.5%-12.0%。该方法简便快捷,消耗资源小,检测成本低,所提及的前处理过程、涉及化合物以及测定所用仪器可以与已有方法进行很好的互补,适用于葛根中主要黄酮苷元代表的黄酮类化合物总量的测定要求,可为葛根中黄酮类化合物的准确测定,提供有力的技术保障。附图说明图1-图3为目标化合物的总离子流图(溶液浓度10ng/mL);图1为葛根素、甘草素、大豆素、野黄芩素、大豆黄素、槲皮素、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,该方法包括提取、净化和测定步骤,提取采用盐酸乙醇溶液水解提取法,其特征在于,在提取时在试样中加入T-丁基-1,4-苯酚作为抗氧化剂。/n
【技术特征摘要】
1.一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,该方法包括提取、净化和测定步骤,提取采用盐酸乙醇溶液水解提取法,其特征在于,在提取时在试样中加入T-丁基-1,4-苯酚作为抗氧化剂。
2.根据权利要求1所述的一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,其特征在于,T-丁基-1,4-苯酚的加入量为试样的质量的3-10倍。
3.根据权利要求2所述的一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,其特征在于,提取水解条件为:10wt%盐酸,50VOL%乙醇溶液,T-丁基-1,4-苯酚和氮气保护下,水解120min。
4.根据权利要求3所述的一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,其特征在于,提取如下:称取0.1g试样,精确到0.01g,置于150mL圆底烧瓶中,加0.5gT-丁基-1,4-苯酚,36mL50VOL%的乙醇溶液和4.0mL浓盐酸,在氮气保护下,水浴加热回流120min,氮气保护下冷却后,加水定容至50mL。
5.根据权利要求1所述的一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,其特征在于,净化采用HLB固相萃取柱。
6.根据权利要求5所述的一种葛根中多种黄酮苷元含量同时测定的方法,其特征在于,净化步骤如下:取上述提取上清液1mL,加入9mL水,混匀并转移至HLB固相萃取柱中,依次用5mL甲醇和5mL5VOL%甲醇溶液活化,加入5mL20VOL%甲醇溶液淋洗,抽干,加10mL甲醇进行洗脱,控制流速1mL/min~2mL/min,收集全部洗脱液,定容至10mL,摇匀,过0.22μm有机滤膜,取0.1mL定容...
【专利技术属性】
技术研发人员:侯建波,谢文,史颖珠,李杰,陆顺,毛壬熠,汪鹏,
申请(专利权)人:杭州海关技术中心,
类型:发明
国别省市:浙江;33
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