一种分析灵敏度高的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2，试剂R1中含有以下成分：缓冲液、双甘氨肽、羧甲基壳聚糖、氯化钠、防腐剂；试剂R2中含有以下成分：缓冲液、甘氨酰‑脯氨酰‑对硝基苯胺对甲苯磺酸盐、稳定剂、表面活性剂、防腐剂。本发明专利技术同时提供了该试剂盒的制备方法和应用，该试剂盒是一种灵敏度高、稳定性强、重复性好的液体试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种分析灵敏度高的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术涉及生化试剂测定
，特别涉及一种分析灵敏度高的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(Glycylprolinedipeptidylaminopeptidase,GPDA)于1966年首次被发现，广泛分布于肝、肾、结缔组织、唾液腺及血清、唾液等体液中，细胞内GPDA大部分(55％)分布于微粒体中；细胞可溶部分、胞核和线粒体中的GPDA分别占胞内GPDA总活性的20％，18％和8％。甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶能特异性水解释放肽链N-末端的甘氨酰-脯氨酸(Gly-Pro)，而胶原分子中富含有这种Gly-Pro结构，GPDA的生理作用可能与胶原肽降解有关。胶原是机体内含量最多的蛋白质，是结缔组织的主要成分，也是上皮细胞基底膜的主要组成部分，对于维持这些组织的功能具有重要作用，由上皮细胞或间充质细胞分化而产生的癌组织常含胶原酶，能分解癌组织周围的胶原，可能与癌的浸润和扩散有关，作为胶原分解过程中的二肽氨基肽酶，GPDA也可能起重要作用。已有研究表明，健康成人血清GPDA水平较为恒定，新生儿显著低于成人。从婴儿出生到20岁的生长发育阶段，血清GPDA逐渐升高。这可能与胶原量的增加有关，也提示GPDA在胶原肽降解中的作用。原发性肝癌患者血清GPDA活性增高，并明显高于肝硬化、胆石症、慢性肝炎患者，GPDA活性的测定对原发性肝癌的诊断有一定的特异性，可能反映了原发性肝癌患者胶原分解代谢的亢进。胃癌患者血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的活性明显下降，其它良性胃肠道疾病时，血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的活性也略有降低。血清中GPDA有两种同工酶，GPDA-S和GPDA-F，GPDA-F在AFP含量变化不明显时，是原发性肝癌的重要标志物，和AFP有良好的互补作用(Run-ZhouNietal.2003)。甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶检验方法有荧光法、酶联免疫法和比色法。荧光法、酶联免疫法灵敏度较高，但是操作比较复杂，而且荧光法一般被用来测定GPDA水平较低的尿液标本。比色法一般采用连续监测法，即GPDA催化底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者可引起在规定波长下吸光度的升高，吸光度升高速率与GPDA活性成正比，而市场上甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂存在分析灵敏度低、重复性不好的问题，在用一些精密性稍差的仪器设备中，表现的问题尤为突出。本专利技术通过反复实验，优化反应体系，提供一种用连续监测法检测甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的试剂盒，该试剂盒不仅稳定性好，灵敏度高，重复性也好，并能进行临床样本的批量检测。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种灵敏度高、稳定性强、重复性好的液体试剂盒。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：试剂R2中含有以下成分：优选地，试剂R1中所述缓冲液为2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液；试剂R2中所述缓冲液为N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(Taps)缓冲液。优选地，试剂R1的pH值为7.0-10.0；试剂R2的pH值为6.0-10.0。优选地，试剂R2中所述的稳定剂为海藻酸钠和硫酸葡聚糖。优选地，试剂R1中所述的防腐剂为叠氮钠、PC300、咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯中的一种或多种；试剂R2中所述的防腐剂为叠氮钠、PC300、咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯中的一种或多种。优选地，试剂R2中所述的表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮k12、烷基酚聚氧乙烯醚op-10的一种或两种。优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1。更优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。上述所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)试剂R1的配制：取适量水，分别依次加入R1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到pH值7.0-10.0，定容到所需体积；(2)试剂R2的配制：取适量水，分别依次加入R2中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到pH值6.0-10.0，定容到所需体积。本专利技术还公开了该试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的浓度。本专利技术基本原理如下：在碱性条件下，GPDA催化底物甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者可引起在405nm波长下吸光度的升高，吸光度升高速率与GPDA活性成正比。甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐甘氨酰脯氨酸+对硝基苯胺本专利技术的有益效果：1)本专利技术选择甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐作为反应底物，这种底物安全性高，同时添加羧甲基壳聚糖，对反应有增效作用，反应后显色能力强，提高了试剂的分析灵敏度。2)在试剂R1和R2中都添加缓冲液，试剂R1中优选2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液，试剂R2中优选TAPS缓冲液，R1中的缓冲液进行孵育，去除干扰，R2中的缓冲液能够有效提高GPDA催化活性，保证显色效果，抑制其他的副反应，有利于提高试剂的重复性。3)在试剂的R2中加入了海藻酸钠和硫酸葡聚糖，可协同提高底物的溶解性和稳定性，同时添加表面活性剂，表面活性剂有乳化作用和助溶作用，可进一步提高底物溶液的稳定性，而且刺激GPDA酶发挥最大活性。附图说明图1为实施例1和对比例1试剂的相关性曲线；图2为对比例2和对比例1试剂的相关性曲线；图3为实施例1和对比例1、2、4、5、6、7提供的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。具体实施方式以下是本专利技术的具体实施例结合附图说明，对本专利技术的技术方案作进一步的描述，但本专利技术并不限于这些实施例。本专利技术试剂盒测定血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的测试条件为：方法：速率法；主/副波长：405nm/800nm；温度：37℃；校正类型：线性；校准方法：两点定标；反应方向：向上。具体操作如表1所示。表1甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂操作步骤计算结果：样本要求：1.不溶血血清。2.样本稳定性：标本2～8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。实施例1一种分析灵敏度高的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。试剂R1的组分为：试剂R2的组分为：试剂R1的pH值为7.5；试剂R2的pH值为8.8；制备方法:(1)试剂R1的配制：取适量水，分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；/n试剂R1中含有以下成分：/n缓冲液 50-200mmol/L/n双甘氨肽 20-120mmol/L/n羧甲基壳聚糖 1-20g/L/n氯化钠 1-20g/L/n防腐剂 0.5-2g/L/n试剂R2中含有以下成分：/n缓冲液 50-200mmol/L，/n甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐 10-100mmol/L/n稳定剂 1-20g/L/n表面活性剂 1-20g/L/n防腐剂 0.5-2g/L。/n...

【技术特征摘要】
1.一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；
试剂R1中含有以下成分：
缓冲液50-200mmol/L
双甘氨肽20-120mmol/L
羧甲基壳聚糖1-20g/L
氯化钠1-20g/L
防腐剂0.5-2g/L
试剂R2中含有以下成分：
缓冲液50-200mmol/L，
甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐10-100mmol/L
稳定剂1-20g/L
表面活性剂1-20g/L
防腐剂0.5-2g/L。


2.根据权利要求1所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中所述缓冲液为2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液；试剂R2中所述缓冲液为N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液。


3.根据权利要求1所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，其特征在于，试剂R1的pH值为7.0-10.0；试剂R2的pH值为6.0-10.0。


4.根据权利要求1所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，其特征在于，试剂R2中所述的稳定剂为海藻酸钠和硫酸葡聚糖。


5.根据权利要求1所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中所述的防腐剂为叠氮钠、PC300...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘安娜，
申请(专利权)人：中科梅奥山东医学检验有限公司，中拓生物有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37