一种外泌体包裹AAV载体、AAV-靶基因载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因药物载体技术领域，公开一种外泌体包裹AAV载体、AAV‑靶基因载体及其制备方法和应用。将HEK‑293T细胞用DMEM完全培养基培养，待细胞生长至融合度达60%‑80%时用于转染，转染前1‑4 h用DMEM基础培养基置换旧的培养基；将pAAV‑ZsGreen质粒或pAAV‑靶基因‑ZsGreen质粒、pRC2‑miR342质粒和pHelper质粒共转染至HEK‑293T细胞培养液中，37℃共转染12‑16 h之后，加入无外泌体胎牛血清，继续培养48‑72 h，收集上清，离心分离，获得外泌体包裹AAV或AAV‑靶基因载体。所述外泌体包裹AAV‑靶基因载体在制备治疗靶基因所对应疾病药物中的应用。本发明专利技术制备的外泌体包裹AAV‑靶基因载体，相较于AAV‑靶基因载体，外泌体的天然膜结构可有效增强AAV在视网膜组织中的转运，增加靶基因转染效率。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体包裹AAV载体、AAV-靶基因载体及其制备方法和应用
本专利技术属于基因药物载体
，具体涉及一种外泌体包裹AAV载体、AAV-靶基因载体及其制备方法和应用。
技术介绍
腺相关病毒(Adeno-associatedvirus,AAV)是属微小病毒科家族的无包膜病毒。AAV对人无致病性，只有在辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒存在下才能复制。AAV基因组是约4.7kb的单链线状DNA分子，在每个末端都有发夹结构的反向末端重复序列(ITRs)，ITRs的功能在于基因组复制起始位点及包装病毒粒子。AAV病毒中能够插入小于2.5kb大小的DNA片段。AAV载体在体内基因转染效率高，整体安全性好，已成为首选的基因药物载体。AAV虽然是首选药物载体，由于生物本身存在中和抗体、血脑屏障和血眼屏障等原因，临床试验治疗效果远不及动物实验效果。因此考虑AAV的转染效率不佳造成差异。外泌体(exosomes)由含有跨膜蛋白、胞质蛋白和各种核酸的脂质双层组成。其粒径在40~200nm之间，主要是细胞膜内陷形成的包含溶酶体微粒的多囊泡体(MVBs)，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。是一种很有前途的新型药物和基因传递载体。与传统AAV载体比较，外泌体作为基因药物载体具有以下优点：1.外泌体具有粒径小、生物相容性高、免疫性低等优点；2.外泌体可以递送基因药物、蛋白质和小分子药物等；3.外泌体可以穿过血脑屏障和血眼等屏障，且在体内对中和抗体表现出显著的抗性；4.外泌体包裹AAV载体(exo-AAV)可以绕过需要AAV衣壳与细胞受体结合进入细胞这一过程从而提高转染效率；5.外泌体载体不仅能将基因药物更有效送至靶组织，同时保护内容物不被降解。
技术实现思路
为克服现有技术中存在的不足之处，本专利技术的目的旨在提供一种外泌体包裹AAV载体、AAV-靶基因载体及其制备方法和应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种外泌体包裹AAV载体的制备方法，步骤如下：（1）、将HEK-293T细胞用DMEM完全培养基培养，待细胞生长至融合度达60%-80%时用于转染，转染前1-4h用DMEM基础培养基置换旧的培养基；（2）、将pAAV-ZsGreen质粒、pRC2-miR342质粒和pHelper质粒共转染至步骤（1）所得HEK-293T细胞培养液中，37℃共转染12-16h之后，加入无外泌体胎牛血清，继续培养48-72h，收集上清，离心分离，获得外泌体包裹AAV载体。具体地，步骤（2）的过程为：将10-15μgpAAV-ZsGreen质粒、10-15μgpRC2-miR342质粒和20-25μgpHelper质粒加入50-100μLCaCl2溶液和水中，三质粒均以其溶液形式添加且溶液浓度均为1-2μg/μL，CaCl2溶液的浓度为2-3M，水的用量为三质粒溶液总体积的10倍，吹打混匀；将混匀的三质粒溶液涡旋状态下滴加到500-1000μL2×HeBS溶液中，室温静置20-30min后，再滴加到8-10mL步骤（1）所得HEK-293T细胞培养液中，37℃共转染12-16h之后，加入160-200μL无外泌体胎牛血清继续培养48-72h，收集细胞培养上清，离心分离，获得外泌体包裹AAV载体。具体地，步骤（2）中，所述离心分离的过程为：首先，3-5℃300-600g离心10-15min，离心结束收集上清液，然后将收集的上清液3-5℃2000-2500g离心10-15min，离心结束收集上清液；进一步将收集的上清液3-5℃100000g离心1-1.5h，离心结束去除上清，收集底部沉淀，加入PBS重悬沉淀，再次3-5℃100000g离心1-1.5h，离心结束去除上清，收集底部沉淀，所得沉淀即为外泌体包裹AAV载体。一种利用所述制备方法制备的外泌体包裹AAV载体。一种外泌体包裹AAV-靶基因载体的制备方法，步骤如下：（1）、pAAV-ZsGreen质粒首先经过EcoRI酶切，获得线性pAAV-ZsGreen质粒；然后通过同源重组法将靶基因构建到线性pAAV-ZsGreen质粒中，通过无内毒素质粒大提试剂盒提取pAAV-靶基因-ZsGreen质粒；（2）、将HEK-293T细胞用DMEM完全培养基培养，待细胞生长至融合度达60%-80%时用于转染，转染前1-4h用DMEM基础培养基置换旧的培养基；（3）、将pAAV-靶基因-ZsGreen质粒、pRC2-miR342质粒和pHelper质粒共转染至步骤（2）所得HEK-293T细胞培养液中，37℃共转染12-16h之后，加入无外泌体胎牛血清，继续培养48-72h，收集上清，离心分离，获得外泌体包裹AAV-靶基因载体。较好地，步骤（1）中，EcoRI酶切体系为：浓度150-200ng/μL的pAAV-ZsGreen质粒溶液3-5μL、EcoRI酶1-2μL、10×Buffer溶液2-4μL，补水至总体系20μL；酶切条件为：37℃16-18h，70-80℃5-10min；构建体系为：浓度150-200ng/μL的线性pAAV-ZsGreen质粒溶液1-2μL、浓度30-50ng/μL的靶基因cDNA溶液2-5μL、2×SoSoo溶液3-5μL，补水至总体系10μL；构建条件为：50℃15-20min；2-4℃∞。具体地，步骤（3）的过程为：将10-15μgpAAV-靶基因-ZsGreen质粒、10-15μgpRC2-miR342质粒和20-25μgpHelper质粒加入50-100μLCaCl2溶液和水中，三质粒均以其溶液形式添加且溶液浓度均为1-2μg/μL，CaCl2溶液的浓度为2-3M，水的用量为三质粒溶液总体积的10倍，吹打混匀；将混匀的三质粒溶液涡旋状态下滴加到500-1000μL2×HeBS溶液中，室温静置20-30min后，再滴加到8-10mL步骤（2）所得HEK-293T细胞培养液中，37℃共转染12-16h之后，加入160-200μL无外泌体胎牛血清继续培养48-72h，收集细胞培养上清，离心分离，获得外泌体包裹AAV-靶基因载体。具体地，步骤（3）中，所述离心分离的过程为：首先，3-5℃300-600g离心10-15min，离心结束收集上清液，然后将收集的上清液3-5℃2000-2500g离心10-15min，离心结束收集上清液；进一步将收集的上清液3-5℃100000g离心1-1.5h，离心结束去除上清，收集底部沉淀，加入PBS重悬沉淀，再次3-5℃100000g离心1-1.5h，离心结束去除上清，收集底部沉淀，所得沉淀即为外泌体包裹AAV-靶基因载体。一种利用所述制备方法制备的外泌体包裹AAV-靶基因载体。一种所述外泌体包裹AAV-靶基因载体在制备治疗靶基因所对应疾病药物中的应用。本专利技术中，所述靶基因包括但不限于下列基因：人源Retinoschisin1、CHM、BEST1、RPE65、ND1~6、SOD2、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外泌体包裹AAV载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：/n（1）、将HEK-293T细胞用DMEM完全培养基培养，待细胞生长至融合度达60%-80%时用于转染，转染前1-4 h用DMEM基础培养基置换旧的培养基；/n（2）、将pAAV-ZsGreen质粒、pRC2-miR342质粒和pHelper质粒共转染至步骤（1）所得HEK-293T细胞培养液中，37 ℃共转染 12-16 h之后，加入无外泌体胎牛血清，继续培养48-72 h，收集上清，离心分离，获得外泌体包裹AAV载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种外泌体包裹AAV载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）、将HEK-293T细胞用DMEM完全培养基培养，待细胞生长至融合度达60%-80%时用于转染，转染前1-4h用DMEM基础培养基置换旧的培养基；
（2）、将pAAV-ZsGreen质粒、pRC2-miR342质粒和pHelper质粒共转染至步骤（1）所得HEK-293T细胞培养液中，37℃共转染12-16h之后，加入无外泌体胎牛血清，继续培养48-72h，收集上清，离心分离，获得外泌体包裹AAV载体。


2.如权利要求1所述的外泌体包裹AAV载体的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程为：将10-15μgpAAV-ZsGreen质粒、10-15μgpRC2-miR342质粒和20-25μgpHelper质粒加入50-100μLCaCl2溶液和水中，三质粒均以其溶液形式添加且溶液浓度均为1-2μg/μL，CaCl2溶液的浓度为2-3M，水的用量为三质粒溶液总体积的10倍，吹打混匀；将混匀的三质粒溶液涡旋状态下滴加到500-1000μL2×HeBS溶液中，室温静置20-30min后，再滴加到8-10mL步骤（1）所得HEK-293T细胞培养液中，37℃共转染12-16h之后，加入160-200μL无外泌体胎牛血清继续培养48-72h，收集细胞培养上清，离心分离，获得外泌体包裹AAV载体。


3.如权利要求1所述的外泌体包裹AAV载体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述离心分离的具体过程为：首先，3-5℃300-600g离心10-15min，离心结束收集上清液，然后将收集的上清液3-5℃2000-2500g离心10-15min，离心结束收集上清液；进一步将收集的上清液3-5℃100000g离心1-1.5h，离心结束去除上清，收集底部沉淀，加入PBS重悬沉淀，再次3-5℃100000g离心1-1.5h，离心结束去除上清，收集底部沉淀，所得沉淀即为外泌体包裹AAV载体。


4.一种利用如权利要求1~3任一所述制备方法制备的外泌体包裹AAV载体。


5.一种外泌体包裹AAV-靶基因载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）、pAAV-ZsGreen质粒首先经过EcoRI酶切，获得线性pAAV-ZsGreen质粒；然后通过同源重组法将靶基因构建到线性pAAV-ZsGreen质粒中，通过无内毒素质粒大提试剂盒提取pAAV-靶基因-ZsGreen质粒；
（2）、将HEK-293T细胞用DMEM完全培养基培养，待细胞生长至融合度达60%-80%时用于转染，转染前1-4h用DMEM基础培养基置换旧的培养基；
（3）、将pAAV-...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷博，王卫萍，刘婧阳，郝冰涛，
申请(专利权)人：河南省眼科研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41