基于转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因工程细胞株以及基于该细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法，该细胞株通过慢病毒感染方式，将绿色荧光蛋白GFP和糖皮质激素受体GR融合蛋白基因整合入Hela细胞染色体中，通过嘌呤霉素puro筛选，最终获取稳定表达GFP‑GR的Hela细胞株。基于稳定表达GFP‑GR的Hela细胞株，通过测定GFP‑GR结合激素配体从细胞质区域迁移至细胞核区域的迁移比率，可高通量、低成本、快速检测不同样品中的糖皮质激素类混合物的阳性检出率，以地塞米松计灵敏度可达10

【技术实现步骤摘要】
基于转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种基于GFP-GR-puroHela细胞转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法。
技术介绍
慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷I型病毒(humanimmunodeficiencyvirus-1，HIV-1)为基础发展起来的一种基因治疗载体。基因工程中较为常用的病毒载体有三种：逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。其中，逆转录病毒载体只能感染分裂期的细胞，且载体容量有限；腺病毒在感染细胞后，目的基因一般不能整合至宿主细胞的染色体上，只能进行瞬时感染表达；而慢病毒不同于前面两种病毒，其不仅具有可感染分裂期和非分裂期细胞的能力，而且还具有载体容纳外源性基因片段大，以及可长期表达目的基因的特点。糖皮质激素是肾上腺皮质激素的一种，可分别通过糖皮质激素受体(glucocorticoidsreceptor,GR)和盐皮质激素受体(mineralocorticoidsreceptor，MR)发挥其功能。自然条件下，机体通过昼夜循环进行糖皮质激素释放和调节，过量或长期低剂量糖皮质激素类药物暴露，会引起机体免疫抑制及多种副作用产生，如代谢紊乱、高血压、肥胖、性成熟提前以及生育力降低等。糖皮质激素类药物可用于治疗肾上腺皮质功能不全、炎症、过敏以及多种皮肤疾病等；在养殖业中也广泛使用，常见药物有地塞米松、泼尼松龙、氢化可的松、倍他米松等。随着药物的广泛使用，通过人源及畜禽饲养排放，经过畜禽迁移代谢以及生态环境迁移归趋后，已知分子结构的糖皮质激素类药物可能发生结构变化，从而产生结构类似并具有糖皮质激素内分泌干扰效应的未知污染物。这些已知和未知的污染物以更为复杂、多样的方式在生物和生态链中富集和迁移，将最终影响人类身体健康和环境生物的多样性。大量已知和未知糖皮质激素类混合物及其代谢产物可能会被漏检或无法检出，而现有质谱和酶联免疫等方法在满足高通量、灵敏度、时间和成本之间存在不平衡。目前尚未大量针对糖皮质激素类混合物进行摸底排查和风险监测，原因主要在于成本昂贵和检测时间较长。因此，开发新型、通量更高、成本更低、更为广谱性/非靶向性，以及节省检测时间的监测检测方法至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于转基因工程细胞株检测糖皮质激素类混合物的检测方法，通过基因工程手段将GFP和GR的融合蛋白作为目的基因，克隆到慢病毒载体质粒中，构建转基因工程细胞株，基于该细胞株通过测定GFP-GR结合激素配体从细胞质区域迁移至细胞核区域的迁移比率，可以高通量、低成本、快速的检测不同样品中的糖皮质激素类混合物含量。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种转基因工程细胞株，通过慢病毒感染方式，将绿色荧光蛋白GFP和糖皮质激素受体GR融合蛋白基因整合入Hela细胞染色体中，通过嘌呤霉素puro筛选，最终获得稳定表达GFP-GR的Hela细胞株。本专利技术还提供一种基于所述的转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法，包括以下步骤：步骤1：利用慢病毒包装GFP-GR基因，再感染Hela细胞，获取GFP-GR-puroHela细胞转基因工程细胞株；步骤2：向所构建的GFP-GR-puroHela转基因工程细胞株中加入糖皮质激素类混合物后，通过测定荧光信号从细胞质向细胞核区域的迁移比率，定量和半定量确定糖皮质激素类含量(具体为测定阳性检测率)，以地塞米松计灵敏度可达为10-9mol/L。优选的是，步骤1中构建GFP-GR-puroHela细胞转基因工程细胞株具体包括以下步骤：步骤a：将合成的GFP-GR目的基因连接到病毒载体FV026上，构建Lenti-GFP-GR载体；步骤b：将Lenti-GFP-GR载体、psPAX2载体、pMD2G载体按着质量比2:1:1混合，按照脂质体介导法转染293T细胞，进行病毒包装；步骤c：将步骤b中检测合格的病毒悬液用于感染Hela细胞，再用含有嘌呤霉素puro的DMEM完全培养基进行筛选，得到所述GFP-GR-puroHela细胞转基因工程细胞株。优选的是，步骤b中所述293T细胞用于转染前，先进行消化，重新接种到细胞培养皿中，待生长至汇合率80％-90％即可用于转染实验。优选的是，检测合格的病毒悬液的滴度为1E+7TU/mL。本专利技术提供一种所述的转基因工程细胞株的应用，应用于医药健康、食品安全及环保领域，定量检测体液、食品及环境水源中糖皮质激素类混合物的含量。优选的是，应用于定量检测人体和畜禽体液、乳品、污水不同样本中的糖皮质激素类混合物的含量。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术使用的慢病毒载体主要包括载体质粒FV026辅助质粒psPAX2(pHelper1)和辅助质粒pMD2G(pHelper2)三种质粒。以绿色荧光蛋白和糖皮质激素受体的融合蛋白基因为目的基因，通过基因工程手段将目的基因克隆到慢病毒载体质粒中；再将载体质粒和两个辅助质粒三者共转染到293T细胞，完成病毒包装；制备好的病毒上清液经纯化后再次感染293T细胞，进行病毒滴度检测；最后用检测好的病毒上清液感染宿主Hela细胞，通过嘌呤霉素筛选，获得稳定转染GFP-GR的Hela细胞。筛选的稳定转染GFP-GR的Hela细胞可用于糖皮质激素类内分泌干扰效应检测，细胞培养环境中不存在糖皮质激素类混合物时，GFP-GR以结合多种热休克蛋白和免疫亲和素的蛋白复合体形式存在于细胞质中；当有糖皮质激素类混合物时，GFP-GR结合相应激素配体并从蛋白复合体中脱离出来，进而迁移至细胞核区域。该过程GFP-GR绿色荧光信号由细胞质移动到细胞核区域，测定质核迁移比率，此比率可作为阳性判定及半定量检测样本糖皮质激素类含量水平的依据。本申请实现了高通量、低成本、快速的定量检测样本中糖皮质激素类混合物。附图说明图1为GFP-GR-puroHela转基因工程细胞株的监测原理机制图；A为慢病毒包装和感染宿主细胞原理示意图；B为转基因细胞添加糖皮质激素类药物时引发质核迁移示意图；C为高内涵筛选系统；图2为Lenti-GFP-GR电泳图；泳道M、6、7和8分别为marker和Lenti-GFP-GR载体(FC-2338)；图3为三质粒共转染293T细胞,分别采集转染24h、48h的细胞明场和GFP图像；图4为病毒感染293T细胞判断滴度，分别采集加入100μL和10μL病毒上清液感染293T细胞的明场和GFP图像；图5为筛选后GFP-GR-puroHela细胞的明场和GFP图像；Brightfield为明场，GFP为荧光信号；100x和200x分别代表放大100倍和200倍；图6为GFP-GR-puroHela细胞荧光信号质核转移情况；Control组加入DMSO(0.1％)；17β-E2组为添加10-7mol/L雌二醇；Dexa组添加10-7mol/L地塞米松；给药后孵育1h后，固定细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因工程细胞株，其特征在于，通过慢病毒感染方式，将绿色荧光蛋白GFP和糖皮质激素受体GR融合蛋白基因整合入Hela细胞染色体中，通过嘌呤霉素puro筛选，最终获得稳定表达GFP-GR的Hela细胞株。/n

【技术特征摘要】
1.一种转基因工程细胞株，其特征在于，通过慢病毒感染方式，将绿色荧光蛋白GFP和糖皮质激素受体GR融合蛋白基因整合入Hela细胞染色体中，通过嘌呤霉素puro筛选，最终获得稳定表达GFP-GR的Hela细胞株。


2.一种基于权利要求1所述的转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：利用慢病毒包装GFP-GR基因，再感染Hela细胞，获取GFP-GR-puroHela细胞转基因工程细胞株；
步骤2：向所构建的GFP-GR-puroHela转基因工程细胞株中加入糖皮质激素类混合物后，通过测定荧光信号从细胞质向细胞核区域的迁移比率，可半定量/定量确定糖皮质激素类混合物含量(以地塞米松计)。


3.如权利要求2所述的基于转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法，其特征在于，步骤1中构建GFP-GR-puroHela细胞转基因工程细胞株具体包括以下步骤：
步骤a：将合成的GFP-GR目的基因连接到病毒载体FV026上，构建Lenti-GFP-GR载体；
步骤b：将Lenti-GFP-GR载...

【专利技术属性】
技术研发人员：李耘，刘畅，钱永忠，邱静，任亚林，李金娟，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11