一种可条件性过表达HPV E7的小鼠成纤维细胞株及其应用，鼠成纤维细胞株的构建包括以下步骤：步骤一，cKI小鼠原代成纤维细胞分离；步骤二，cKI小鼠原代成纤维细胞永生化诱导与筛选；步骤三，永生化‑cKI小鼠原代成纤维细胞Cre酶诱导与鉴定。本发明专利技术将启动子序列定点嵌入到小鼠基因组H11位点，只有在特定Cre酶存在情况下，才会在特异细胞或组织中表达目的基因，本发明专利技术通过系列原代细胞分离、永生化及体外Cre诱导的步骤，提供了种可条件性过表达HPV E7的小鼠成纤维细胞株及其应用，有效解决当前技术存在问题。
【技术实现步骤摘要】
一种可条件性过表达HPVE7的小鼠成纤维细胞株及其应用
本专利技术涉及分子生物学与生物医学
，具体地，涉及一种可条件性过表达HPVE7的小鼠成纤维细胞株及其应用。
技术介绍
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在妇科恶性肿瘤中仅次于乳腺癌。近年来我国宫颈癌发病率呈上升态势，且趋于年轻化。人乳头瘤病毒(HPV)属乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是一种球形DNA病毒。目前已有200多种HPV亚型被鉴定，根据其致癌性可分为高危型HPV(hrHPV)与低危型HPV(1rHPV)。持续性hrHPV感染是宫颈高度病变及宫颈癌发生的主要诱因，90％以上的宫颈癌组织携带hrHPV(16，18，31型)DNA，但HPV感染导致宫颈癌发生的分子机制仍不太明了。HPV基因组分为3个部分：早期基因区(E)、晚期基因区(L)及长调控区(LCR)。其中，早期基因区(E)的E7是明确的致癌基因。hrHPV(如HPV16)E7可编码具有转化及反式激活功能的蛋白，其阳性表达与宫颈病变程度之间呈正相关，被证实是导致宫颈上皮癌变的重要因子。且不同型的HPV致癌能力与其各自E7与Rb蛋白结合能力等有关，结合越紧密，其致癌能力越强。对E7基因及其蛋白产物在宫颈癌发生发展过程中的机制、宫颈癌诊疗与疫苗研发等方面开展深入研究具有重要的医学应用价值。研究认为，HPV可通过微小的创口感染鳞状上皮基底层细胞，与基底层细胞表面受体结合并黏附于细胞表面。其病毒体(virion)进入细胞所需的条件还不清楚。病毒一旦进入细胞，HPVDNA可在基底层细胞向表层上皮分化的过程中复制。目前针对HPV及E7等癌基因的研究主要集中于角质细胞、上皮来源肿瘤细胞。然而，不可忽视的是，肿瘤是由肿瘤细胞及其周围基质细胞和非细胞组分构成的复合体，肿瘤的发生发展是肿瘤细胞与其微环境相互促进、共同演化的动态过程。例如，肿瘤相关成纤维细胞，作为肿瘤微环境中最主要的组成成分之一，被报道与肿瘤发生发展、侵袭转移、血管生成与耐药性获得等过程密切相关，可通过打破组织细胞间的稳态，继而使微环境更有利于肿瘤生长。大量研究提示，肿瘤组织中的成纤维细胞可在肿瘤细胞的某种调控下转化成为肿瘤相关成纤维细胞，继而与肿瘤细胞相互调节，共同促进疾病恶性进展。新近研究发现，在HPV+肿瘤细胞/角质细胞外泌体中可检测到E7等癌基因的表达，且部分临床样本免疫组化结果提示，该类分子可在成纤维细胞中检测到，那么以E7为代表的HPV癌基因是否可借助外泌体等传递介质，进入成纤维细胞，进而产生系列潜在的、未知的病理效应。是否可促进成纤维细胞转变为肿瘤相关成纤维细胞，参与宫颈癌恶性进展。上述科学问题的探讨，对于全面评价hrHPVE7的促癌机制，尤其是在诱导正常细胞恶性转化及肿瘤微环境调控等过程具有重要意义。经研究发现，目前技术存在以下不足之处：1、目前针对HPV及E7等癌基因的研究主要集中于角质细胞、上皮来源肿瘤细胞，而对于以E7为代表的HPV癌基因在成纤维细胞及肿瘤微环境中的研究尚且不足。2、当前研究者多采用传统的载体转染与抗生素筛选，以获得E7高表达的成纤维细胞，存在转染效率不佳、筛选时间长问题；或利用病毒系统包装与感染体系，联合抗生素筛选，以获得E7高表达的成纤维细胞，在一定程度上改善了传统脂质体转染效率不佳、筛选时间长的问题，但是，由上述方式筛选的稳转细胞株，其E7整合是随机的，有的发生于单位点，也有的情况下整合于不同染色体的多个位点上，其随机性可能造成基因组的重排、易位缺失，外源E7基因插入可能破坏细胞内源基因；此外整合的拷贝数不固定，多拷贝串联整合可能导致外源基因表达率低甚至不表达，不利于控制基因的表达水平及功能研究。综上，需要开发一种可条件性过表达HPVE7的小鼠成纤维细胞株及其应用。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种可条件性过表达HPVE7的小鼠成纤维细胞株及其应用，本专利技术充分利用前期基于CRISPR-Cas9技术构建在H11位点条件性过表达E7基因的小鼠模型，该模型将“启动子-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPVE7-筛选标记-polyA”序列定点嵌入到小鼠基因组H11位点，由于启动子与目的基因E7之间用loxP-STOP-loxP结构隔开，使得正常情况下启动子无法启动E7基因的表达。只有在特定Cre酶存在情况下，才会在特异细胞或组织中表达目的基因，本专利技术通过系列原代细胞分离、永生化及体外Cre诱导的步骤，提供了种可条件性过表达HPVE7的小鼠成纤维细胞株及其应用，有效解决当前技术存在问题。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种可条件性过表达HPVE7的小鼠成纤维细胞株，所述小鼠成纤维细胞株的构建包括以下步骤：步骤一，HPVE7-H11conditionalknockin(cKI)小鼠原代成纤维细胞分离；步骤二，HPVE7-H11cKI小鼠原代成纤维细胞永生化诱导与筛选；步骤三，永生化-HPVE7-H11cKI小鼠原代成纤维细胞Cre酶诱导与鉴定。一种条件性过表达HPV16E7的小鼠成纤维细胞株的应用，利用所构建MF-HPV16E7-Cre细胞株，对小鼠成纤维细胞生长速率的应用。本专利技术和现有技术相比，其优点在于：优点(1)本专利技术提出的细胞株为国内外首次报道建立，为HPV感染与宫颈癌发病机制的研究、宫颈癌靶向药物研发、药效评价提供了有效的实验细胞模型，有很好的实用价值。优点(2)本专利技术充分利用前期基于CRISPR-Cas9技术构建在H11位点条件性过表达E7基因的小鼠模型，该模型将“启动子-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPVE7-筛选标记-polyA”序列定点嵌入到小鼠基因组H11位点，由于启动子与目的基因E7之间用loxP-STOP-loxP结构隔开，使得正常情况下启动子无法启动E7基因的表达。只有在特定Cre酶存在情况下，才会在特异细胞或组织中表达目的基因；优点(3)本专利技术利用H11位点作为HPVE7的特定插入位点，该位点已被证明与Rosa26类似，可用于较为广泛地表达外源基因；该位点位于小鼠第11号染色体Eif4enifl与Drg1两个基因之间，外源基因插入后影响内源基因表达的风险很小，且同时H11位点所在的Eif4enif1与Drg1这两个基因的侧翼序列区域具有广泛的空间和时间EST(expressionsequencetag)表达模式，可使整合在此的外源基因受指定启动子的驱动而稳定表达。优点(4)本专利技术实现了小鼠原代成纤维细胞中单拷贝HPVE7的插入，更容易预测表达量；且在打靶载体中及Cre载体中增加了筛选标记，后续可通过此类标记对模型进行灵活的检测；优点(5)本专利技术通过差速贴壁法分离纯化HPV16E7-H11conditionalknockin(cKI)小鼠及对照小鼠原代成纤维细胞，在确保纯度＞99.5％情况下，对其进行永生化诱导，所述永生化原代成纤维细胞株在体外可连续传代，细胞形态、增殖动力学和遗传特征稳定；...
【技术保护点】
1.一种可条件性过表达HPV E7的小鼠成纤维细胞株，其特征在于，所述小鼠成纤维细胞株的构建包括以下步骤：/n步骤一，HPV E7-H11 conditional knock in小鼠原代成纤维细胞分离；/n步骤二，HPV E7-H11 cKI小鼠原代成纤维细胞永生化诱导与筛选；/n步骤三，永生化-HPV E7-H11 cKI小鼠原代成纤维细胞Cre酶诱导与鉴定。/n
【技术特征摘要】
1.一种可条件性过表达HPVE7的小鼠成纤维细胞株，其特征在于，所述小鼠成纤维细胞株的构建包括以下步骤：
步骤一，HPVE7-H11conditionalknockin小鼠原代成纤维细胞分离；
步骤二，HPVE7-H11cKI小鼠原代成纤维细胞永生化诱导与筛选；
步骤三，永生化-HPVE7-H11cKI小鼠原代成纤维细胞Cre酶诱导与鉴定。
2.根据权利要求1所述的可条件性过表达HPVE7的小鼠成纤维细胞株，其特征在于，
步骤一，HPV16E7-H11conditionalknockin小鼠原代成纤维细胞分离
步骤1-1、取经基因型鉴定的同窝6-8周雌性小鼠各一只，安乐死后剪取小鼠尾巴，75％酒精浸泡消毒后转移至超净工作台内，置于装有含1％青霉素/链霉素双抗的磷酸盐缓冲液培养皿中；
步骤1-2、洗去小鼠尾巴表面毛发，手术刀移去表面皮肤，再放入Ca2+,Mg2+磷酸盐缓冲液中洗3遍，以去除残留血液与脂肪组织，用眼科剪将鼠尾剪成2mm左右的组织小块；
步骤1-3、小心放入六孔板中，六孔板含600μL完全培养液，高糖DMEM+1％双抗+10％胎牛血清，确保组织块均匀且充分贴住六孔板底，置于37℃，5％CO，90％湿度的细胞培养箱培养24h；
步骤1-4、次日补加3mL完全培养基，培养3-5天，每2天换一次液；约8-10天后，细胞可达80-100％接合度，采用差速贴壁法进行消化传代以纯化目的细胞，成纤维细胞完全贴壁时间＜2小时；
步骤二，HPV16E7-H11cKI小鼠原代成纤维细胞永生化诱导与筛选
基于步骤1分离所得HPVE7-H11cKI小鼠原代成纤维细胞，对其进行永生化诱导与筛选：
步骤2-1、永生化病毒包装
步骤2-(1)第一天，取对数生长期HEK-293T铺板，调节细胞浓度至4*106个细胞/dish；
步骤2-(2)第二天，待细胞生长至80％-90％接合度，换液9mL，并按如下比例配制转染体系：1mLopti-MEM中，加入pLenti-SV40LT-puro质粒10μg，psPAX210μg，pMD2...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁奕，唐林香，张梦娇，李昂，何胜祥，
申请(专利权)人：江苏同科医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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