一种利用反相色谱分离分析左西孟旦中右西孟旦的方法技术

本发明专利技术涉及色谱分析方法技术领域，具体公开了一种利用反相色谱分离分析左西孟旦中右西孟旦的方法。其步骤如下：a.用磷酸缓冲液与乙腈混合液配置待测溶液；b.将待测溶液注入到以在烷基硅烷键合硅胶表面涂敷多糖衍生物的手性填充剂为固定相的高效液相色谱仪中，用流动相进行冲洗；c.使用波长为200～400nm的紫外光检测。本发明专利技术首次使用反相色谱手性分离方法进行了左西孟旦的手性分析，填补了技术空白；并且使用到了以下流动相：水、甲醇或乙腈，磷酸盐，这些试剂常见且便宜，挥发性差，操作简单，分离时间短，灵敏度高，分离效果好，对环境污染小，运行稳定，对仪器不造成损伤，具有良好的实用性。

【技术实现步骤摘要】
一种利用反相色谱分离分析左西孟旦中右西孟旦的方法
本专利技术涉及色谱分析方法
，具体涉及一种利用反相色谱分离分析左西孟旦中右西孟旦的方法。
技术介绍
左西孟旦：(R)–[[4–(1，4，5，6–四氢–4–甲基–6–氧代–3–哒嗪基)苯基]–亚肼基]–丙二腈，分子式为：C14H12N6O分子量为280.28。右西孟旦：(S)–[[4–(1，4，5，6–四氢–4–甲基–6–氧代–3–哒嗪基)苯基]–亚肼基]–丙二腈，分子式为：C14H12N6O分子量为280.28。左西孟旦是由芬兰Orion公司研究开发，并于2000年在瑞典首次以商品名“Simdax”上市，作为一种钙增敏剂，是一种新型的心力衰竭治疗药物，临床主要用于充血性心衰的治疗。作用机理是以钙离子浓度依赖的方式与心肌肌钙蛋白C结合而产生正性肌力作用，增强心肌收缩力，但并不影响心室舒张；同时本品可通过使ATP敏感的K+通道(KATP)开放而产生血管舒张作用，使得冠状动脉阻力血管和静脉容量血管舒张，从而改善冠脉的血流供应，另外它还可抑制磷酸二酯酶Ⅲ。临床数据证明：在心衰患者中，左西孟旦的正性肌力和扩血管作用可以使心肌收缩力增强，降低前后负荷，而不影响其舒张功能。近年来由于对映体之间的药效学，药代动力学和毒理学差异的证据越来越多，立体化学现在已成为药物研究和开发中的关键问题。由于手性的分析方法能够将化学活性物质与其对映异构体分离，有利于确定其结构和具体含量，因此手性HPLC方法是开发高质量制造工艺和质量控制方法的关键步骤。r>左西孟旦有一个手性中心，并且从上市资料看，其有效成分是R构型，因此在合成阶段检测控制S构型的异构体，对控制成品的质量至关重要。现有的手性分离一般分为正相色谱和反相色谱两种。正相色谱是流动相极性比色谱柱极性小，正相色谱的常用流动相是正己烷，正庚烷，甲基叔丁基醚，乙酸乙酯，乙醇，异丙醇等，易挥发，成本高；反相色谱是流动相极性比色谱柱极性大，反相色谱的常用流动相是水，甲醇，乙腈等，不易挥发，成本较低。查阅现有文献，虽然该药已经上市19年，但是尚未进入各国药典，无法定的手性分析方法可以参考。查阅国内外的文献，仅有两篇国外的文献使用了正相色谱的手性分离技术对左西孟旦和右西孟旦进行分离，但是使用到了大量的色谱级甲基叔丁基醚、乙醇、异丙醇或三氟乙酸等强挥发性有机试剂，价格昂贵、毒性大、易挥发、空气污染大、吸入人体后对人体伤害比较大并且对环境也不友好；且仪器需要从反相系统切换到正相系统消耗时间大约3小时，操作繁琐，一旦失误，对色谱仪器伤害比较大，也会对昂贵的手性色谱柱会造成难以逆转的伤害，而且正相溶剂对仪器的伤害比较大，长期使用会造成管路老化，密封垫圈损坏，流动相泄露。因此急需要建立一种灵敏度高、分离效果好的反相手性色谱方法进行分离。
技术实现思路
为了弥补现有技术中存在的不足、填补现有技术中的技术空白，本专利技术提供了一种利用反相高效液相色谱分离分析左西孟旦中右西孟旦的方法，可以准确测定左西孟旦中右西孟旦的含量。本专利技术操作方法简单、理论塔板数、分离度、不对称度等均能满足药物分析检测的要求，检测灵敏、方便迅速，实现了左西孟旦和右西孟旦的分离，满足了研发和生产的需求，适合于左西孟旦中右西孟旦的测定。实现本专利技术上述目的所采用的技术方案为：一种左西孟旦中右西孟旦的反相高效液相色谱分析检测方法，包括如下步骤：a.取待测左西孟旦药物，用稀释剂配制成含左西孟旦1.4～500μg/mL的溶液；所述稀释剂为pH2.0～4.0的磷酸缓冲液与乙腈体积比＝(45～15):(55～85)的混合溶液；优选的，所配制的溶液中左西孟旦浓度为500μg/mL；优选的，所述流动相为用磷酸缓冲液和乙腈体积比为(90～55):(10～45)的混合液，其中磷酸缓冲液为用磷酸调节磷酸二氢钠溶液pH至2.0～4.0所得溶液，所述磷酸缓冲液中磷酸二氢钠的浓度为5～25mmol/L，最佳为20mmol/L；所述混合液中磷酸缓冲盐和乙腈最佳体积为65:35；b.取上述含左西孟旦10～1000μg/mL的溶液适量，注入到高效液相色谱仪中，用流动相进行冲洗，所述高效液相色谱仪中色谱柱是以在烷基硅烷键合硅胶表面涂敷多糖衍生物的手性填充剂为固定相；所述烷基硅烷键合硅胶优选C8～C18烷基硅烷键合硅胶，最佳为十八烷基硅烷键合硅胶(C18烷基硅烷键合硅胶)；所述多糖衍生物选自直链淀粉衍生物和/或纤维素衍生物，最佳是纤维素衍生物。c.使用波长为200～400nm的紫外光检测，最佳检测波长为378nm，其次为287nm。所述待测左西孟旦药物优选为左西孟旦原料药。所述待测左西孟旦药物应包含右西孟旦。与现有技术相比，本专利技术方法的优点和有益效果在于：1、首次使用反相色谱手性分离方法进行了左西孟旦的手性分析，填补了技术空白；2、本技术方案采用了一种反相色谱手性分离技术，使用到了以下流动相：水、甲醇或乙腈，磷酸盐，这些试剂常见且便宜，挥发性差，操作简单，分离时间短，灵敏度高，分离效果好，对环境污染小，运行稳定，对仪器不造成损伤；3、根据实施例3的实验发现，当进样浓度为0.082ug/mL，进样量为20ul，实际进样的量为1.64ng时，信噪比为21.3，符合定量限的要求(信噪比大于10)。附图说明图1为实施例1中系统适用性溶液的HPLC分析图；磷酸缓冲盐和乙腈体积比为70:30；图2为实施例2中左西孟旦消旋体的HPLC分析图；磷酸缓冲盐(调pH＝3.1)和乙腈体积比为70:30；图3为实施例3中左西孟旦消旋体的HPLC分析图；磷酸缓冲盐(调pH＝3.1)和乙腈体积比为65:35；图4为实施例4中左西孟旦消旋体的HPLC分析图；磷酸缓冲盐(调pH＝3.1)和乙腈体积比为60:40；图5为实施例3中空白的HPLC分析图；图6为实施例3中左西孟旦的定位图；图7为实施例3中右西孟旦的定位图；图8为实施例3中左西孟旦和右西孟旦的定位对比图；图9为实施例3中左西孟旦和右西孟旦的紫外吸收曲线图；图10为实施例3中左西孟旦待测品溶液(批号：JNK-170925-WYJ-156-015-14)的HPLC图；图11为实施例3中左西孟旦待测品溶液(批号：JNK-170925-WYJ-156-025-14)的HPLC图；图12为实施例3中左西孟旦待测品溶液(批号：JNK-170925-WYJ-156-033-18)的HPLC图。图13为实施例3中定量限溶液的HPLC图。具体实施方式下面申请人将结合具体实施例对本专利技术的方法做进一步的详细说明。以下实施例中，所用主要仪器和试剂如下：仪器：DIONEXUltimate3000高效液相色谱仪，采用大赛璐CHIRALCELOJ-3R色谱柱，内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种左西孟旦中右西孟旦的反相高效液相色谱分析检测方法，包括如下步骤：/na.取待测左西孟旦药物，用稀释剂配制成含左西孟旦1.4～500μg/mL的溶液；/n所述稀释剂为pH2 .0～4.0的磷酸缓冲液与乙腈体积比=(45～15):(55～85)的混合溶液；/n所述磷酸缓冲液中磷酸二氢钠的浓度为5～25mmol/L；/nb.取上述含左西孟旦10～1000μg/mL的溶液适量，注入到高效液相色谱仪/n中，用流动相进行冲洗，所述高效液相色谱仪中色谱柱是以在烷基硅烷键合硅胶表面涂敷多糖衍生物的手性填充剂为固定相；/n所述流动相为用磷酸缓冲液和乙腈体积比为(90～55):(10～45)的混合液；/nc.使用波长为200～400nm的紫外光检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种左西孟旦中右西孟旦的反相高效液相色谱分析检测方法，包括如下步骤：
a.取待测左西孟旦药物，用稀释剂配制成含左西孟旦1.4～500μg/mL的溶液；
所述稀释剂为pH2.0～4.0的磷酸缓冲液与乙腈体积比=(45～15):(55～85)的混合溶液；
所述磷酸缓冲液中磷酸二氢钠的浓度为5～25mmol/L；
b.取上述含左西孟旦10～1000μg/mL的溶液适量，注入到高效液相色谱仪
中，用流动相进行冲洗，所述高效液相色谱仪中色谱柱是以在烷基硅烷键合硅胶表面涂敷多糖衍生物的手性填充剂为固定相；
所述流动相为用磷酸缓冲液和乙腈体积比为(90～55):(10～45)的混合液；
c.使用波长为200～400nm的紫外光检测。


2.根据权利要求1所述的反相高效液相色谱分析检测方法，其特征在于：所述烷基硅烷键合硅胶为C8～C18烷基硅烷键合硅胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓斌，
申请(专利权)人：武汉嘉诺康医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42