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糖链相对定量同位素标记质谱衍生化试剂制造技术

技术编号:24329291 阅读:56 留言:0更新日期:2020-05-29 19:04
本发明专利技术公开了一种糖链相对定量同位素标记质谱衍生化试剂,具体指d0‑DPBOC,d5‑DPBOC试剂。试剂结构中含有

Derivatization reagents of relative quantitative isotope labeling mass spectrometry of sugar chain

【技术实现步骤摘要】
糖链相对定量同位素标记质谱衍生化试剂
本专利技术涉及生物分析领域糖蛋白中糖链的相对定量分析,特别是指疾病糖链标志物筛选用高灵敏度、高选择性同位素标记质谱衍生化试剂。
技术介绍
糖基化是蛋白质翻译后修饰最普遍且最复杂的形式之一。人体中约有70%以上的蛋白质被糖基化,其结构的复杂多样性和微不均一性使得糖链具有了更多的分支结构、连接方式和空间构象。糖链的结构变化和表达量的改变与人类免疫、炎症、肿瘤和代谢等疾病密切相关。可现阶段还无法在完整糖蛋白的水平上对糖链的详细结构信息进行研究,因此,现大多采用从糖蛋白多肽骨架上释放寡糖链,然后再进一步研究糖链结构与功能的关系。虽然以糖链结构为分析对象的糖链定性研究已取得了很大的进展,但因糖链的结构复杂多样,加之标准品难以合成,故还没有更有效的糖链定量分析方法。因此,发展和建立高灵敏、快速、简便的糖链定量分析方法对探索筛选真正有效的糖链生物标志物和重组抗体药物的靶标治疗,蛋白质糖基化规律及差异糖组学研究具有重要意义。因糖链本身没有发色基团且在质谱分析中不易离子化,所以在其结构分析时一般采用柱前衍生化方法。使得糖链带上紫外或荧光基团,提高检测灵敏度,同时增加糖链的疏水性和在反相色谱柱中的保留,有利于糖链的分离和检测。传统的分析糖蛋白糖链的方法一般是利用肼解法或酶法进行糖链的切割并纯化后进行分析。目前常用的糖链衍生化试剂为芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)、异硫氰基荧光素(FITC)等荧光衍生化试剂和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、2-氨基苯甲酸胺(2-AB)等质谱衍生化试剂,虽然荧光检测器灵敏度高、选择性强,但由于糖链结构的复杂性和其含量的差异性,含量较低的糖链在荧光检测器中往往检测不到。LC-MS和基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)由于其高灵敏度和特异性已成为糖链分析的有利工具,另外,其操作简便,分析速度快,重现性好等优点广为大众所接受。虽然利用这些试剂对糖链进行标记后可以用于HPLC分离后在荧光或MS上进行检测,可以在一定程度上能提高糖链分析的选择性和灵敏度,但这些试剂的化学反应条件较难控制,不同糖链结构需要摸索不同的衍生化条件,不仅容易发生去糖基化现象,而且需要多步程序其手续繁琐费时。以上所述虽然在糖链的定性分析方法方面取得了一定的进展,但在定量分析方面尚不完善。目前,基于LC-MS和MALDI-MS检测的化学标记为糖链相对定量分析的有效方法,主要包括绝对定量和相对定量两种方法。但糖链标准品难以合成且价格昂贵难以获取,因此,目前主要采用同位素标记的相对定量分析。稳定同位素标记的相对定量则是将化学性质相同、质量不同的稳定同位素作为内标,对不同生理或病理状态下的生物体中的糖链进行标记,然后按等比例混合样品,相同的糖链会因质量上的差异在质谱图中出现一对同位素特征峰。由于它们具有相同的离子化效率,可以通过比较这一对峰的相对丰度,分析糖链在不同生理状态下表达量的变化。鉴于此,需开发一种基于液相-高分辨质谱(LC-HRMS)相对定量标记糖链的新型质谱衍生化试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术之不足而提供一种糖链相对定量同位素标记质谱衍生化试剂。本专利技术的技术方案为:一种糖链相对定量同位素标记质谱衍生化试剂,首先以同位素苯甲酰氯(d0/d5-BZC)为起始物,与丙半胱氨酸(OTZD)反应合成中间体(d0/d5-BZC-OTZD),其次以中间体(d0/d5-BZC-OTZD)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在脱水剂的存在下反应合成d0/d5-DPBOC,该d0/d5/-DPBOC的具体结构式如下:。本专利技术是为了相对定量糖蛋白的糖链,链酶蛋白酶E(PronaseE)是一种非特异性蛋白酶。可随机作用于糖蛋白质多肽上的不同位点,非特异性地将N-/O-连接糖蛋白上结合的肽段同时一次性酶解成只含有一个氨基酸的糖链(糖氨酸),即N-连接(N-Glycan-Asn)和O-连接(N-Glycan-Ser/Thr)糖链,获得的糖氨酸只含有一个氨基酸。所以提供一种稳定轻、重同位素标记质谱衍生化试剂标记酶切后的糖氨酸的氨基基团进行糖链的相对定量。由于具有稳定轻、重同位素结构的试剂在质谱分析中一价离子质量差为Δm=5,二价离子质量差为Δm=2.5,三价离子质量差为Δm=1.67可以在无标准品的情况下对糖链进行相对定量分析。本专利技术以d0/d5稳定轻、重同位素标记苯甲酰氯为母体,与丙半胱氨酸(OTZD)反应,以N-羟基琥珀酰亚胺为活化羧基基团开发具有高灵敏度、高选择性的糖链相对定量分析用d0/d5同位素标记质谱衍生化试剂。该质谱衍生化试剂的开发,将对发展和建立高灵敏、高选择性的糖蛋白糖链的相对定量分析方法及筛选癌症早期糖链生物标志物具有重要意义。本专利技术针对非特异性链酶蛋白酶E(PronaseE)酶切的糖链与新合成的稳定同位素质谱衍生化试剂d0/d5-DPBOC进行反应,开发糖链的相对定量分析方法。为差异性糖组学的发展与糖链标志物的筛选提供有效、可靠的分析方法。附图说明图1为具体实施方式中d0-DPBOC质谱衍生化试剂的LC-MS质量色谱图。图2为具体实施方式中d5-DPBOC质谱衍生化试剂的LC-MS质量色谱图。图3为具体实施方式中d0-DPBOC质谱试剂的LC-HRMS的质谱图(m/z=349.048[M+H]+)。图4为具体实施方式中d5-DPBOC质谱试剂的LC-HRMS的质谱图(m/z=354.080[M+H]+)。图5为具体实施方式中链酶蛋白酶E酶切唾液酸糖肽SGP的结构示意图。图6为具体实施方式中d0(d5)-DPBOC质谱衍生化试剂与SGA的反应结构式。图7为具体实施方式中SGA的LC-HRMS质量色谱图。图8为具体实施方式中d0-DPBOC-SGA的LC-HRMS质量色谱图。图9为具体实施方式中d5-DPBOC-SGA的LC-HRMS质量色谱图。图10为具体实施方式中SGA的LC-HRMS[M+H]+质谱图([M+H]+=2337.83740)。图11为具体实施方式中SGA的LC-HRMS[M+2H]2+质谱图([M+2H]2+=1169.42065)。图12为具体实施方式中SGA的LC-HRMS[M+3H]3+质谱图([M+3H]3+=779.94977)。图13为具体实施方式中d0-DPBOC-SGA的LC-HRMS[M+H]+质谱图([M+H]+=2570.94849)。图14为具体实施方式中d0-DPBOC-SGA的LC-HRMS[M+2H]2+质谱图([M+2H]2+=1285.98315)。图15为具体实施方式中d0-DPBOC-SGA的LC-HRMS[M+3H]3+质谱图([M+3H]3+=857.65747)。图16为具体实施方式中d5-DPBOC-SGA的LC-HRMS[M+H]+质谱图([M+H]+=2575.98267)。图17为具体实施方式中d5-DPBOC-本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种糖链相对定量同位素标记质谱衍生化试剂,首先以同位素苯甲酰氯 (d0/d5-BZC) 为起始物,与丙半胱氨酸 (OTZD) 反应合成中间体(d0/d5-BZC-OTZD),其次以中间体(d0/d5-BZC-OTZD) 与

【技术特征摘要】
1.一种糖链相对定量同位素标记质谱衍生化试剂,首先以同位素苯甲酰氯(d0/d5-BZC)为起始物,与丙半胱氨酸(OTZD)反应合成中间体(d0/d5-BZC-OTZD),其次以...

【专利技术属性】
技术研发人员:闵俊哲罗苗石清肖淑云许春燕
申请(专利权)人:延边大学
类型:发明
国别省市:吉林;22

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