T7 RNA聚合酶变体制造技术

本发明专利技术提供了工程化RNA聚合酶变体和包含这些变体的组合物。本发明专利技术还提供了工程化T7 RNA聚合酶变体和包含这些变体的组合物。这些变体已经被演化用于在体外转录起始时相对于GTP选择性掺入m7G(5’)ppp(5’)m7G帽类似物。本发明专利技术还提供了用于对RNA转录物选择性加帽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】T7RNA聚合酶变体本申请要求于2017年6月30日提交的美国临时专利申请序号62/527,740和于2017年7月5日提交的美国临时专利申请序号62/528,840的优先权，这两项美国临时专利申请为了所有目的通过引用以其整体并入。专利
本专利技术提供了工程化RNA聚合酶变体和包含这些变体的组合物。本专利技术还提供了工程化T7RNA聚合酶变体和包含这些变体的组合物。这些变体已经被演化用于在体外转录起始时相对于GTP选择性掺入m7G(5’)ppp(5’)m7G帽类似物。本专利技术还提供了用于对RNA转录物选择性加帽的方法。对序列表、表格或计算机程序的引用序列表的正式副本作为ASCII格式化文本文件经由EFS-Web与说明书同时提交，文件名为“CX8-168USP1_ST25.txt”，创建日期为2017年7月5日，并且大小为184,320字节。经由EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。专利技术背景RNA聚合酶，也称为“DNA依赖性RNA聚合酶”，将DNA转录成RNA转录物。这些酶代表驱动转录的主要机器(primarymachinery)。RNA聚合酶已经被充分地分离和纯化，使得它们可用于体外产生RNA。体外转录是这样的程序：允许任何序列的RNA分子的DNA引导的合成，所述任何序列的RNA分子尺寸在从短寡核苷酸至几千碱基的范围内。通常，体外转录包括模板的工程化，随后使用相应的RNA聚合酶进行转录，所述模板包括感兴趣序列上游的噬菌体启动子序列(例如，来自T7大肠杆菌噬菌体)。通常，这些RNA转录物随后被修饰(例如，通过加帽、剪接、添加聚A尾等)。这些转录物用于分析技术(例如，杂交分析)、用于结构研究(例如，NMR和X射线晶体学)、用于生化和遗传学研究(例如，作为反义试剂)、用作功能性分子(例如，核酶和适体)以及用作治疗剂。此外，作为酶替代疗法的治疗剂的mRNA的开发，突显了在高成本效益、商业化产生mRNA(包括有效产生修饰的mRNA)的方面存在的重大商业障碍。专利技术概述本专利技术提供了工程化T7RNA聚合酶变体及其组合物。这些变体已经被演化用于在体外转录起始时相对于GTP选择性掺入m7G(5’)ppp(5’)m7G帽类似物。本专利技术还提供了用于对RNA转录物选择性加帽的方法。此外，本专利技术提供了包含本文提供的RNA聚合酶变体的方法和组合物。本专利技术提供了工程化RNA聚合酶，该工程化RNA聚合酶包含与参考序列SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:15或其功能片段具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多肽序列，其中该工程化RNA聚合酶在多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQIDNO:4或SEQIDNO:15编号。在一些实施方案中，工程化RNA聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：32/357、49/642、97/357、136、137、160/643、167/514、250、302/513、314/401、357、392、393、394、397、401、404、444、446、478、513、514、582、635、636、637、639、642、643、645、653、656、660、660/806、661和664，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQIDNO:4编号。在一些另外的实施方案中，工程化RNA聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：32V/357I、49G/642L、97D/357G、136E/I、137W、160L/643S、167N/514L、250D、302V/513G、314C/401V、357G/K/L/M/N/Q/R/S/T/V/W、392D、393L/Y、394A/L/R、397F/M/Q/W、401A/I/L/S/V、404E/Y、444F/H/I/V、446W/Y、478F/M/W、513C/F/K/L/R/T/W、514F/I/L/Y、582N、635W、636L、637G/P/S、639H、642L、643A、645V、653C、656F/W、660A/C/M/S/T/W、660N/806Y、661E/Y和664W，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQIDNO:4编号。在一些另外的实施方案中，工程化RNA聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：A32V/E357I、E49G/M642L、E97D/E357G、A136E/I、D137W、R160L/T643S、K167N/S514L、T250D、A302V/D513G、R314C/R401V、E357G/K/L/M/N/Q/R/S/T/V/W、Y392D、R393L/Y、K394A/L/R、A397F/M/Q/W、R401A/I/L/S/V、S404E/Y、N444F/H/I/V、M446W/Y、D478F/M/W、D513C/F/K/L/R/T/W、S514F/I/L/Y、A582N、S635W、V636L、T637G/P/S、R639H、M642L、T643A、A645V、F653C、Q656F/W、D660A/C/M/S/T/W、D660N/H806Y、T661E/Y和P664W，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQIDNO:4编号。在一些实施方案中，工程化RNA聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：397/513/635、397/513/635/660、513/660/664、513/635/660、513/635/664、513/660/664和660/664，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQIDNO:4编号。在一些另外的实施方案中，工程化RNA聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：397F/513W/635W、397F/513Y/635W、397W/513Y/635W、397W/513W/635W、397W/513Y/635W/660F、397W/513W/635W/660W、397Y/513W/635W/660F、475V/513W/635W/660Y、513F/660W/664Y、513W/635W/660F、513W/635W/664W、513Y/635W/660F、513Y/635W/660Y、513Y/660W/664W和660Y/664W，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQIDNO:4编号。在一些另外的实施方案中，工程化RNA聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：A397F/D513W/S635W、A397F/D513Y/S635W、A397W/D513Y/S635W、A397W/D513W/S635W、A397W/D513Y/S635W/D660F、A397W/D513W/S635W/D660W、A397Y/D513W/S635W/D660F、A475V/D513W/S635W/D660Y、D513F/D660W/P664Y、D513W/S635W/D660F、D513W/S635W/P664W本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化RNA聚合酶，其中所述聚合酶在转录起始期间利用帽或帽类似物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 US 62/527,740;20170705 US 62/528,8401.一种工程化RNA聚合酶，其中所述聚合酶在转录起始期间利用帽或帽类似物。


2.如权利要求1所述的工程化RNA聚合酶，其中所述RNA聚合酶在转录起始期间优先利用帽或帽类似物。


3.如权利要求1或2所述的工程化RNA聚合酶，其中所述RNA聚合酶在转录延伸期间不利用帽或帽类似物。


4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶是工程化T7RNA聚合酶。


5.如权利要求4所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化T7RNA聚合酶包含相对于SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:15的至少一个取代。


6.一种工程化RNA聚合酶，所述工程化RNA聚合酶包含与参考序列SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:15或其功能片段具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多肽序列，其中所述工程化RNA聚合酶在所述多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQIDNO:4或SEQIDNO:15编号。


7.如权利要求6所述的工程化RNA聚合酶，其中至少一个取代或取代集选自397/513/635、397/513/635/660、513/660/664、513/635/660、513/635/664、513/660/664和660/664，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQIDNO:4编号。


8.如权利要求6所述的工程化RNA聚合酶，其中至少一个取代或取代集选自397、397/513、397/513/635、397/513/635、397/513/635/656、397/513/635/656/660、397/513/635/656/660/664、397/513/635/656/664、397/513/635/660、397/513/635/660/664、397/513/635/664、397/513/656/660、397/513/660、397/513/660/664、397/513/664、397/513、397/635、397/635/656/660/664、397/635/656/664、397/635/660、397/635/664、397/635/664/850、397/660、397/664，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQIDNO:4编号。


9.如权利要求6所述的工程化RNA聚合酶，其中至少一个取代或取代集选自113/137/513、136/357/404/514、136/357/514、136/394/404/446、136/401、136/401/404、136/404/446、136/404/514、136/446、136/514、137、137/401、137/401/513、137/401/513、137/513、137/513/621、137/635、137/656、357/394/401/404/514、357/394/446/514、357/514、394/446/514、401/404、401/404/514、401/513/635、401/635、513/635、513/635/656、513/660、635/656、635/660和660，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQIDNO:15编号。


10.如权利要求6所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶包含与表5.3、表5.4、表5.5和/或表5.6中列出的至少一种工程化RNA聚合酶变体的序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的多肽序列。


11.如权利要求6所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶包含表5.3、表5.4、表5.5和/或表5.6中提供的变体工程化聚合酶。


12.如权利要求6所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶包含与SEQIDNO:4、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和/或39中列出的至少一种工程化RNA聚合酶变体的序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的多肽序列。


13.如权利要求6所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶包含SEQIDNO:4、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39中列出的变体工程化聚合酶。


14.如权利要求1-13中任一项所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化聚合酶与野生型T7RNA聚合酶相比表现出至少一种改进的性质。


15.如权利要求14所述的工程化RNA聚合酶，其中所述至少一种改进的性质选自转录起始期间相对于GTP对帽类似物改进的选择性、改进的蛋白质表达、储存缓冲液中改进的稳定性和反应条件下改进的稳定性。


16.如权利要求1-15中任一项所述的工程化RNA聚合酶，其中所述聚合酶保持RNA收率、转录保真性、热稳定性、蛋白质表达、在-20℃的稳定性或在反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修·G·米勒，庄静斌，奥斯卡·阿尔维左，美利莎·安·梅奥，詹姆斯·尼古拉斯·里金斯，易翔，乔纳森·S·彭菲尔德，吉伽特·W·哈思曼，贾瑞德·戴维斯，五月女靖，
申请(专利权)人：科德克希思公司，
类型：发明
国别省市：美国;US