SCA基因突变检测的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及脊髓小脑共济失调基因测序诊断领域，具体而言，涉及一种SCA基因突变检测的引物、试剂盒及方法。本发明专利技术所提供的引物、试剂盒结合三代测序方法，可有效对SCA 1、2、3、6、7、8、12、17型基因的重复序列动态突变和/或中断重复进行检测。

【技术实现步骤摘要】
SCA基因突变检测的引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及脊髓小脑共济失调基因测序诊断领域，具体而言，涉及一种SCA基因突变检测的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
脊髓小脑性共济失调(spinocerebellarataxia，SCA)是一种最常见的神经系统遗传病，约占神经系统遗传性疾病的10％-15％[1]，发病率约为3/10万。在临床医学各科室的遗传病中，以神经系统遗传病的病种最多，病因最复杂、异质性也最高，约占所有遗传病的60％以上。该系统的神经系统疾病是由三核苷酸或五核苷酸动态突变扩展引起的，多呈常染色体显性遗传，其病理改变主要是脊髓、小脑和脑干的神经元变性脱失与胶质增生[2-3]，临床表现为小脑共济失调伴构音障碍、意向性震颤、锥体系及锥体外系症状等，具有极强的遗传异质性和基因多效性，还可累及脊神经、颅神经、交感神经、大脑皮质等[4]。根据该疾病的临床特点及其基因定位可分为SCA1-30，共30多种亚型，且大部分致病基因已得到克隆。其中SCA1/2/3/6/7/8/12/17亚型为常见的致病基因类型，多为其编码区CAG三核苷酸重复序列扩增突变异常增多导致[5]。各亚型间具有高度临床异质性，临床表现复杂，易与其他神经系统疾病混淆，各亚型之间SCA的临床表现重叠，只依据临床表现较难对其做出明确诊断及分型。目前可通过PCR技术结合毛细管电泳或测序进行基因突变检测来明确诊断，如内中日友好医院、华西医科大学等均是通过PCR技术结合毛细管电泳或测序证实脊髓小脑共济失调的亚型。目前，国内外基因诊断技术日趋成熟，特别是毛细管电泳片段长度分析检测方便、经济，亦可较准确地检测计算出CAG重复数，不仅可以为动态突变的遗传性疾病提供可靠的基因诊断[6]，而且也可用于大批量标本的检测。据报道脊髓小脑共济失调病例中，SCA3是最常见的亚型，其次为SCA1/2/6/7/8/12/17。SCA各个亚型的发病率在不同国家不同地区甚至是不同人群的发病率亦有差别[5,7]，我国目前报道的SCA病例中，SCA3亚型最为常见，占54.6-72.5％，其次为SCA2(5.7-6.7％)，SCA1(5.9％)，SCA6(1.6-3.3％)，SCA7(0.8-4.8％)[8]。总体而言，SCA3、SCA2及SCA1为我国常见亚型。目前，诊断该病主要依据基因检测，明确致病基因CAG三碱基的重复数来确诊，因此界定SCA相关基因CAG的重复数/范围对疾病的诊断及分型具有重大意义。有鉴于此，特提出本专利技术。附：参考文献[1]蔡美英,兰风华.遗传性共济失调的分子病理学研究进展[J].解放军医学杂志,2008(05):624-625.[2]MartindaleJE.DiagnosisofSpinocerebellarAtaxiasCausedbyTrinucleotideRepeatExpansions[J].CurrProtocHumGenet,2017,92:9-30.[3]OrrHT,ZoghbiHY.Trinucleotiderepeatdisorders[J].AnnuRevNeurosci,2007,30:575-621.[4]BruscoA,GelleraC,CagnoliC,etal.Moleculargeneticsofhereditaryspinocerebellarataxia:mutationanalysisofspinocerebellarataxiagenesandCAG/CTGrepeatexpansiondetectionin225Italianfamilies[J].ArchNeurol,2004,61(5):727-733.[5]KrysaW,SulekA,RakowiczM,etal.HighrelativefrequencyofSCA1inPolandreflectingapotentialfoundereffect[J].NeurolSci,2016,37(8):1319-1325.[6]OrrHT,ZoghbiHY.Trinucleotiderepeatdisorders[J].AnnuRevNeurosci,2007,30:575-621.[7]SuzukiK,SatoT,YamadaM,etal.DRPLA:recentadvancesinresearchusingtransgenicmousemodels[J].MethodsMolBiol,2013,1010:277-292.[8]OrrHT,ChungMY,BanfiS,etal.ExpansionofanunstabletrinucleotideCAGrepeatinspinocerebellarataxiatype1[J].NatGenet,1993,4(3):221-226.
技术实现思路
本专利技术涉及一种引物对组合产品，其选自下列引物对中的至少一对：SEQIDNO：1和2、SEQIDNO：3和4、SEQIDNO：5和6、SEQIDNO：7和8、SEQIDNO：9和10、SEQIDNO：11和12、SEQIDNO：13和14、SEQIDNO：15和16。本专利技术所提供的引物对组合产品，可以直观的分析三碱基的重复数及碱基重复类型。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的引物对组合产品。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及一种检测SCA基因重复序列动态突变和/或中断重复的方法，包括：a)获得如上所述的组合物；b)对所述组合物中的扩增子的两端进行末端修复，再向经过末端修复的DNA两端连接扩增接头以构建三代测序的文库模型并上机测序；所述方法包括诊断及非诊断用途。毛细管电泳及一代测序是检测三碱基的重复数及碱基重复类型的常用方法，均需要通过PCR扩增技术，对受检样本进行PCR扩增。其中，毛细管电泳方法的扩增引物为携带荧光的侧翼引物序列。后续需要对扩增产物进行毛细管电泳，依据荧光信号读取数值，再根据信号值的大小进行重复数的计算。而一代测序则是利用荧光进行碱基的判读，后续仍然需要毛细管电泳，但受限于技术的局限易产生移码突变/双峰。无法得出重复碱基的类别及重复被中断的次数及类型，仅可得出重复碱基的重复次数。毛细管电泳的读长有限，只有两种即500bp和1200bp。当重复数大于一定的上限时，则毛细管无法进行试验乃至得出有效的结果，Sanger测序技术更是如此。本专利技术所提供的方法采用三代测序，读长绝对满足三/五碱基重复扩展类型且无GC偏好性。测序序列结果不仅可以明确观察出三碱基的重复数及中断碱基类型，且对大量样品的检测显得特别高效，即高通量测序不仅可以同时分析上百个样品，而且还可高效分析同一样本的8种不同基因型重复。准确度/灵敏度/可靠性方面相比毛细管电泳、克隆及二代测序都高。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及如上所述的引物对组合产品、或如上所述的试剂盒在制备脊髓小脑性共济失调的诊断剂中的应用。附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物对组合产品，其选自下列引物对中的至少一对：/nSEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16。/n

【技术特征摘要】
1.一种引物对组合产品，其选自下列引物对中的至少一对：
SEQIDNO：1和2、SEQIDNO：3和4、SEQIDNO：5和6、SEQIDNO：7和8、SEQIDNO：9和10、SEQIDNO：11和12、SEQIDNO：13和14、SEQIDNO：15和16。


2.根据权利要求1所述的引物对组合产品，其中的部分或全部引物连接有barcode序列，以在扩增时用于区分不同样品。


3.一种试剂盒，其包含权利要求1或2所述的引物对组合产品。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基因组DNA提取体系、PCR反应缓冲液、无核酸酶的水、DNA聚合酶、分子量marker中的一种或多种；
优选的，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。


5.根据权利要求3或4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试...

【专利技术属性】
技术研发人员：高玉梅，贺希文，郎娜，梁帆，王洋，汪德鹏，
申请(专利权)人：北京希望组生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11