一种用于巢式扩增的组合引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于巢式扩增的组合引物，所述组合引物包括两轮引物组，每轮引物组分别包括轻链可变区引物和重链可变区引物，各轻重链可变区引物分别包括正向引物组和反向引物组，所述组合引物可实现抗原特异性抗体基因的高效率高通量扩增和和分析。

【技术实现步骤摘要】
一种用于巢式扩增的组合引物及其应用
本专利技术属于抗体发现领域，特别涉及一种用于巢式扩增的组合引物及其应用。
技术介绍
单克隆抗体具有靶点性强、成药性强、副作用小等优点。生物药，尤其是抗体类药已成为药物领域最有活力和前景的一个方向。全球获批抗体有超过80余个，销售额已突破千亿美金。抗体药物研发已构成各大跨国药企和国内药企的主要研发管线。目前一些方法可获得单克隆抗体，比如小鼠杂交瘤技术、人杂交瘤技术、噬菌体文库技术、EBV转化B淋巴细胞技术等。小鼠杂交瘤技术免疫原性高、半衰期短，临床效果有限；而人杂交瘤技术则具有融合效率低、亚克隆易丢失等缺点，噬菌体文库展示技术则在建库过程中易出现轻重链随机配对的情况，并且研发周期长；EBV转化B细胞技术的抗体产量较低。而单B细胞抗体克隆技术可有效解决这些问题，可实现抗原特异性小鼠单克隆抗体的快速克隆和鉴定分析。抗体可变区等位基因众多，多样性极其复杂。小鼠重链可变区VH是由VDJ重排产生，小鼠有250—1000个V片段，有12个D片段，4个J片段。轻链可分为κ和λ两个亚型，在鼠中，二者的比例为19本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于巢式扩增的组合引物，所述组合引物包括第一轮引物组1和第二轮引物组2，所述的第一轮引物组1包含重链可变区引物组1和轻链可变区引物组2；所述的第二轮引物组2包括重链可变区引物组2和轻链可变区引物组2；所述的重链可变区引物组1包含重链可变区正向引物组1和重链可变区反向引物组1；所述的轻链可变区引物组1包含轻链可变区正向引物组1和轻链可变区反向引物组1；所述的重链可变区引物组2包含重链可变区正向引物组2和重链可变区反向引物组2；所述的轻链可变区引物组2包含轻链可变区正向引物组2和轻链可变区反向引物组2；/n所述的重链可变区正向引物组1包含编号为LX1、LX2和LX3引物：/nLX1：AGG...

【技术特征摘要】
1.一种用于巢式扩增的组合引物，所述组合引物包括第一轮引物组1和第二轮引物组2，所述的第一轮引物组1包含重链可变区引物组1和轻链可变区引物组2；所述的第二轮引物组2包括重链可变区引物组2和轻链可变区引物组2；所述的重链可变区引物组1包含重链可变区正向引物组1和重链可变区反向引物组1；所述的轻链可变区引物组1包含轻链可变区正向引物组1和轻链可变区反向引物组1；所述的重链可变区引物组2包含重链可变区正向引物组2和重链可变区反向引物组2；所述的轻链可变区引物组2包含轻链可变区正向引物组2和轻链可变区反向引物组2；
所述的重链可变区正向引物组1包含编号为LX1、LX2和LX3引物：
LX1：AGGAACTGCAGGTGTCC；
LX2：CAGCTACAGGTGTCCACTCC
LX3：TGGCAGCARCAGCTACAGG；
所述的重链可变区反向引物组1包含编号为NX1的引物，
NX1：CAGCTTCCTGCTAATCAGTG；
所述的轻链可变区正向引物组1包含编号为LX54、LX55、LX56和LX57的引物：
LX54：TGATGACCCARACTCCACT
LX55：CTGCTGCTCTGGGTTCCAGG
LX56：TGGAGTCACAGACYCAGG
LX57：TGCTGCTATGGGTATCTG
所述的轻链可变区反向引物组1包含编号为NX7的引物：
NX7：GCACCTCCAGATGTTAACTG；
所述的重链可变区正向引物组2包含LX114、LX115、LX116和LX117的引物：
LX114：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG
LX115：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGG
LX116：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTGCAGCTGAAGSAGTCAGG
LX117：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGG；
所述的重链可变区反向引物组2包含编号为NX12的引物：
NX12:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG；
所述的轻链可变区正向引物组2包含编号为LX142、LX143、LX144和LX145的引物：
LX142：GACAGCAGGAGTGCACTCCRRTRTTGTGATGACCCARAC
LX143：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATTGTGATGACBCAGGC
LX144：GACAGCAGGAGTGCACTCCSAAATTGTKCTCACCCAGTC
LX145：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGMTGACCCAATC；
所述的轻链可变区反向引物组2包含编号为NX19和NX20的引物：
NX19：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC
NX20：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAGTCTGGTCCC。


2.根据权利要求1所述的组合引物，其特征在于：所述的重链可变区正向引物组1还可包含以下序列引物LX4至LX53中的任意1～50个，优选5～20个，优选地包含10～15个：
LX4：TCTGCCTGGTGACWTTCCCA
LX5：CAGCTACAGGGCAGGTG
LX6：TGGAGTTTGGACTTAGTTGGG
LX7：AGRTYCAGCTGCARCAGTCT
LX8：GTGCAGCTTCAGGAGTCAG
LX9：GGCAGCTGCCCAAAGTRYCC
LX10：TGTTGTCAGCCCTTCCTGG
LX11：ACACCTTTAAATGGTATCCAGTGT
LX12：CCTGTCAGTAACTRCAGGTGTCC
LX13：GCTTGGCAGCAGCTCTA
LX14：TCTGCATGCTGACATTCCCA
LX15：CCAAGCTGTGTCCTGTC
LX16：TGCCTGGTGACWTTCCCAAGCTGT
LX17：CTGCCTGGTGACATTCCCA
LX18：AGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX19：GTGCAGCTTCAGGAGTCAGGAC
LX20：GAGGTGAAGCTTCTCGAGTC
LX21：TTTTAAAAGGKGTCCAGWGT
LX22：TTTTAAAAGGTGTCCAGKGT
LX23：CCTGTCAGTAACTRCAGGTGTCC
LX24：ACACTTTTAMATGGTATCCAGTGT
LX25：CGTTCCTGGTATCCTGTCT
LX26：CCAGGTTACTCTGAAAGAGTC
LX27：TTTTAAAAGGGGTCCAGTGT
LX28：GACCTTGCTATTCCTGATGGCAGC
LX29：GAAGTGAAGCTGGTGGAGTC
LX30：TGTTGGGGCTKAAGTGGG
LX31：ATGKACTTGGGACTGARCTGT
LX32：TGCTCTTTTAAAAGATGTCCAGTGT
LX33：AGCTTCAGGAGTCAGGACC
LX34：CAGTGTGAGGTGAAGCTGGT
LX35：TCCTGTGCTTGGCAGCAGCTC
LX36：CAGGTGCAGCTTGTAGAGAC
LX37：ATGCAGCTGGGTCATCTTCTT
LX38：ATGAAGTTGTGGYTRAACTGG
LX39：TGTTGGGGCTKAAGTGGG
LX40：GGCAGTGGTTACAGGGGTC
LX41：CCAGGTTACTCTGAAAGAGTC
LX42：TGTGGACCTTGCTATTCCTGA
LX43：AGRTYCAGCTGCARCAGTCT
LX44：ATGGAGTGGGAACTGAGCTTA
LX45：TGTTGGGGCTGAAGTGGGTTT
LX46：AGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX47：CTTTCCTGGTATCCTGTCT
LX48：CTTTWWMAAGGKRTSCAKTGT
LX49：TGCTCTTTTAAAAGATGTCCAGTGT
LX50：ATGCAGCTGGGTCATCTTCTT
LX51：AAGTGAAGCTGGTGGAGTC。
LX52：TGTTCACAGCCTTTCCTGGT
LX53：GACTGGATTTGGATCACKCTC；
所述的重链可变区反向引物组1还可包含以下序列引物NX2至NX6中的任意1～5个，优选地包含2～3个：
NX2：GAARTAGCCCTTGACCAGGCATC
NX3：AGAAGGTGTGCACACCGCTGGAC
NX4：AGGGGGCTCTCGCAGGAGACGAGG
NX5：CTTTTCTGGATTTCAGCCTCC
NX6：TGGAGTCACAGACYCAGG；
其中，序列出现兼并碱基意义如下：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。


3.根据权利要求1-2任一项所述的组合引物，所述的轻链可变区正向引物组1还可包含以下序列引物LX58至LX113中的任意1～56个，优选5～20个，优选地包含10～15个:
LX58：TGATGACCCARACTCCACT
LX59：CTTGTGCTCTGGATCCCTGG
LX60：TGGACATGAGGGCYCCTGCTCAGT
LX61：CAGTTCCTGTTTCTGTTARTGCTCTGG
LX62：RGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCT
LX63：GCTTGTGCTCTGGATCCC
LX64：ATGAGACCGTCTATTCAGTT
LX65：CAGCTTCCTGCTAATCAGTG
LX66：CTTTTCTGGATTTCAGCCTCC
LX67：CTGCTGCTCTGGGTTCC
LX68：ATGGAAACTCCAGCTTCATTT
LX69：TGGGTGCTGCTGCTCTGGGT
LX70：TGGAGTTTCAGACCCAGG
LX71：CTGCTMTGGGTATCTGGT
LX72：ATGAGGGTCCTTGCTGAG
LX73：TCTTGTTGCTCTGGTTTCCAGG
LX74：TGGAGTCACAGACYCAGG
LX75：GAGGTTCCAGGTTCAGGT
LX76：GCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGC
LX77：TGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT
LX78：TTTTTAGGTGCCAGATGT
LX79：CTAGCTCYTCTCCTCAGYCTTCTTCTCCTC
LX80：TTAGGTCCTTGGTAGGCTGT
LX81：CTSTGGTTGTCTGGTGTTGAYGGA
LX82：GTTGCTGCTGCTGTGGCTTACA
LX83：TCAACTTCTGCTCTTCCTGCTGTTC
LX84：CTCAGCTCCTGTTGCTGTGGC
LX85：CTGCTGCTGTGGCTTACAG
LX86：CWTCTTGTTGCTCTGGTTTC
LX87:AGGGCCCYTGCTCAGTTT
LX88:TCAACTTCTGCTCTTCCTGCTG
LX89:CAGCTTCCTGCTAATCAGTG
LX90:CTCAGATCCTTGGACTTHTG
LX91:CCATGACCATGYTCTCACT
LX92:CTGGGGCTSCTKCTGYTCTG
LX93:CTCTTCTTCTTCTTTGTTCTTCATTGCT
LX94:ATGACCATGYTCTCACTAGC
LX95:GATGTCCTCTGCTCAGTTC
LX96:CCTTCTCAACTTCTGCTCT
LX97:CTGTGGACCACGGTCTCAGCTGTC
LX98:GTATCTGGTACC...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢士强，赵新燕，赵东霞，刘小青，邓婧，任晋生，
申请(专利权)人：先声生物医药科技有限公司，江苏先声药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32