基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法技术

本发明专利技术属于基因突变技术领域，公开了一种基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法，选取一段包含点突变位点的序列作为靶基因；将upstream、IFDC2、downstream片段融合；将融合片段转入变异链球菌中，利用含红霉素的BHI琼脂平板进行阳性克隆筛选及PCR验证；将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为前后两部分；将扩增出的mutant‑upstream和mutant‑downstream片段融合；将融合片段mutant up‑down转入获得的阳性克隆菌株中，利用含p‑Cl‑Phe的BHI平板进行二次筛选及测序验证。本发明专利技术步骤简便，成本低，可重复性高。

Suppression of virulence of Streptococcus mutans by point mutation based on codon preference

【技术实现步骤摘要】
基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法
本专利技术属于基因突变
，尤其涉及一种基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法。
技术介绍
目前，龋病是除冠心病、癌症之后，世界卫生组织列明的三大非传染性慢性病之一。第四次中国口腔健康流行病学调查报告显示，乳牙和年轻恒牙龋病患病水平呈明显上升趋势，防治龋病已成为加强我国人群口腔健康的重点项目。龋病本质是由微生物感染所致的牙体硬组织破坏性疾病，变异链球菌(Streptococcusmutans)是目前公认的主要致龋微生物之一，其致龋毒力机制主要包括对牙面的黏附、利用糖类产生多糖以及较强的产酸和耐酸能力。变异链球菌对牙面的黏附是其定植、致龋的基础，其中葡糖基转移酶(glucosyltransferase，GTF)是当前研究的热点之一。大多数变异链球菌含有至少3种GTF基因，即gtfB、gtfC、gtfD。gtfB编码的GTF-I合成水不溶性葡聚糖(insolubleglucans，IG)，gtfC编码的GTF-SI合成IG和水溶性葡聚糖(solubleglucans，SG)的混合物，gtfD编码的GTF-S合成SG。此外，与变异链球菌黏附素合成相关的表面蛋白P1和P1样蛋白，与产酸性相关的乳酸脱氢酶，与耐酸能性相关的ropA、brpA等毒力因子均是变异链球菌致龋性的重要物质基础。因此，如何通过降低这些毒力因子表达，进而抑制变异链球菌过度生长，减少胞外多糖产生，抑制生物膜形成及产酸耐酸能力，是防治龋病的有效措施。众所周知，在生物体传递遗传信息的过程中，作为联结核酸和蛋白质的密码子扮演着重要的角色。在遗传密码中，mRNA上3个相邻的碱基组成一个密码子，一个密码子可编码一种氨基酸。在生物体中有61种密码子，20种氨基酸，这是由于遗传密码具有简并性，同一氨基酸对应的多个密码子被称为同义密码子。但这些同义密码子在翻译的过程中使用的频率并非一致，这种现象被称为“密码子偏好性”。密码子偏好性广泛存在于不同生物中，是物种在长期进化过程中受环境选择、碱基突变、基因漂变等因素共同作用的结果，其还受到基因组大小、tRNA丰度和基因表达水平等的影响。密码子偏好性对蛋白的表达有着直接的影响，能通过tRNA在翻译水平上改变蛋白的翻译速度。在同一生物中，携带同一种氨基酸的不同tRNA称为同功受体tRNA，tRNA的浓度通常与其读取的密码子的频率正相关。在高度表达的基因中，编码同种氨基酸的密码子中往往有一个密码子在频率上占主导地位，并且该密码子通常由最丰富的tRNA的同种受体读取。因此，将宿主基因中不同频率的同义密码子进行替换，将影响蛋白翻译水平，进而改变相关的表型。在龋病微生物研究中，尤其是变异链球菌的基因编辑中，该技术仍未见详细报道。目前，抑制变异链球菌毒力的方法大多是通过外源性地加入某些药物和小分子化合物或通过引入拮抗菌，竞争性地抑制变异链球菌活性。尽管这些方法能在一定程度上抑制变异链球菌毒力，但它们仍有一些缺点：(1)药物筛选具有盲目性，不能高效准确的找到特异性强的药物，且具体作用成分难以确定；(2)某些小分子的提纯或合成成本昂贵，步骤繁琐；(3)药物及化合物作用的具体机制大多尚不清楚，毒副作用也不明确；(4)某些拮抗菌是否对机体具有潜在毒性未见报道等。此外，也有利用传统的基因敲除方法敲除毒力基因，从而达到抑制效果，但将目的基因敲除常常只是破坏部分外显子而不是整个编码区，残留的编码序列可能组合出新的未知的功能，给表型分析带来麻烦；并且，对于某些必须基因，完整敲除后将造成细胞死亡，也就无法研究这些基因的功能。因此，综合以上原因，亟需寻找一种新的策略来弥补当前技术的不足。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术抑制变异链球菌毒力的方法存在的小分子的提纯或合成成本昂贵，步骤繁琐；作用机制不明确，基因敲除后功能未知或细胞死亡。解决上述技术问题的难度：如何根据密码子频率选择突变位点及方向，从而实现表型变化。解决上述技术问题的意义：可以在不敲除目的基因的前提下改变生物表型，通过抑制基因表达，降低蛋白翻译，减弱变异链球菌毒力，并且操作简便，表型易检测，能直观地反应基因编辑的结果。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法。本专利技术是这样实现的，一种用于抑制变异链球菌毒力方法中进行PCR扩增基因的引物，所述PCR扩增的引物的序列为SEQIDNO：1～SEQIDNO：10。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述引物进行PCR扩增基因的方法，所述PCR扩增基因的方法包括：第一步，选取一段包含点突变位点的序列作为靶基因；第二步，聚合酶链式反应PCR扩增靶基因上游序列作为upstream；第三步，PCR扩增靶基因下游序列作为downstream；第四步，PCR扩增红霉素抗性基因片段IFDC2；第五步，PCR将第二步-第四步中的upstream、IFDC2、downstream片段融合；第六步，将第五步中的融合片段转入变异链球菌中，利用含红霉素的BHI琼脂平板进行阳性克隆筛选及PCR验证；第七步，将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为前后两部分，分别为mutant-upstream和mutant-downstream，二者共同拥有一段20个碱基大小的重叠序列；其中突变位点位于mutant-upstream片段R端重复序列之前；第八步，利用聚合酶链式反应分别扩增出mutant-upstream和mutant-downstream，其中扩增mutant-upstream时，R端引物序列中，与突变位点对应的碱基替换为所需突变的互补碱基；第九步，将第八步扩增出的mutant-upstream和mutant-downstream片段融合，称为mutantup-down；第十步，将第九步中的融合片段mutantup-down转入第六步中获得的阳性克隆菌株中，利用含p-Cl-Phe的BHI平板进行二次筛选及测序验证，即可实现毒力基因的点突变。进一步，所述PCR扩增基因的方法的R端引物序列中，与突变位点对应的碱基替换为所需突变的互补碱基；变异链球菌密码子使用频率表，每1000个密码子中；共581662个密码子。进一步，所述PCR扩增基因的方法利用IFDC2基因盒及等位同源交换技术完成点突变菌株的构建，IFDC2基因盒由启动子ldh、突变的pheS基因片段mpheS及ermAM基因片段三部分构成；基因盒中的ermAM基因片段使转化子带有红霉素抗性从而实现阳性筛选，pheS基因编码苯丙氨酸-tRNA合成酶α亚基，在发生突变并整合入受体菌基因组后，使转化子对苯丙氨酸类似物p-Cl-Phe产生获得性敏感，实现转化子的二次筛选获得无标记的基因突变株。进一步，所述PCR扩增基因的方法选取一段包含突变位点在内的0.63kb长度的片段作为靶基因，其上游同源片段upstream长度为0.76kb，下游同源片段do本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于抑制变异链球菌毒力方法中进行PCR扩增基因的引物，其特征在于，所述PCR扩增的引物的序列为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于抑制变异链球菌毒力方法中进行PCR扩增基因的引物，其特征在于，所述PCR扩增的引物的序列为SEQIDNO：1～SEQIDNO：10。


2.一种利用权利要求1所述引物进行PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法包括：
第一步，选取一段包含点突变位点的序列作为靶基因；
第二步，聚合酶链式反应PCR扩增靶基因上游序列作为upstream；
第三步，PCR扩增靶基因下游序列作为downstream；
第四步，PCR扩增红霉素抗性基因片段IFDC2；
第五步，PCR将第二步-第四步中的upstream、IFDC2、downstream片段融合；
第六步，将第五步中的融合片段转入变异链球菌中，利用含红霉素的BHI琼脂平板进行阳性克隆筛选及PCR验证；
第七步，将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为前后两部分，分别为mutant-upstream和mutant-downstream，二者共同拥有一段20个碱基大小的重叠序列；其中突变位点位于mutant-upstream片段R端重复序列之前；
第八步，利用聚合酶链式反应分别扩增出mutant-upstream和mutant-downstream，其中扩增mutant-upstream时，R端引物序列中，与突变位点对应的碱基替换为所需突变的互补碱基；
第九步，将第八步扩增出的mutant-upstream和mutant-downstream片段融合，称为mutantup-down；
第十步，将第九步中的融合片段mutantup-down转入第六步中获得的阳性克隆菌株中，利用含p-Cl-Phe的BHI平板进行二次筛选及测序验证，即可实现毒力基因的点突变。


3.如权利要求2所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法的R端引物序列中，与突变位点对应的碱基替换为所需突变的互补碱基；变异链球菌密码子使用频率表，每1000个密码子中；共581662个密码子。


4.如权利要求2所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法利用IFDC2基因盒及等位同源交换技术完成点突变菌株的构建，IFDC2基因盒由启动子ldh、突变的pheS基因片段mpheS及ermAM基因片段三部分构成；基因盒中的ermAM基因片段使转化子带有红霉素抗性从而实现阳性筛选，pheS基因编码苯丙氨酸-tRNA合成酶α亚基，在发生突变并整合入受体菌基因组后，使转化子对苯丙氨酸类似物p-Cl-Phe产生获得性敏感，实现转化子的二次筛选获得无标记的基因突变株。


5.如权利要求2所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法选取一段包含突变位点在内的0.63kb长度的片段作为靶基因，其上游同源片段upstream长度为0.76kb，下游同源片段downstream为0.86kb，IFDC2基因长度为2.2kb；第二次转化中，将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为两部分，分别为mutant-up和mutant-dn，mutant-up和mutant-dn含有一段重叠序列–GCCGTGATTGAAGGCA–。


6.如权利要求2所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法细菌培养及基因组gDNA提取，将变异链球菌UA159菌液接种于BHI固体培养基上，37℃、10％H2、5％CO2和85％N2厌氧条件下培养48小时；用接种环挑取一个单菌落接种于3mLBHI液体培养基，37℃、10％H2、5％CO2和85％N2厌氧条件下培养，取过夜培养菌液按细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌gDNA，测定纯度及浓度后-20℃保存。


7.如权利要求6所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法目的片段扩增及连接，以提...

【专利技术属性】
技术研发人员：任彪，王峥，程磊，周学东，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51