一种泛肿瘤基因检测的标准品及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种泛肿瘤基因检测的标准品，包含了微滴式数字PCR(ddPCR)验证的13个突变位点，以及500X高通量全外显子测序验证位点信息，有大于330个基因的700多个变异位点，也包含了常见的基因SNV和碱基插入缺失等癌症基因组常见结构变异，其对应的突变位点频率从1％到100％不等，适用场景和平台广泛。可以用于评估从样本提取到生物信息分析的工作流程的稳定性、特异性和灵敏性，评估各样本处理方法，检测平台之间的性能差异。属于业内的重大创新，具有广泛的应用前景和巨大的产业应用价值。

A standard for Pan tumor gene detection and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种泛肿瘤基因检测的标准品及其制备方法和应用
本专利技术涉及肿瘤基因检测领域，具体涉及一种泛肿瘤基因检测的标准品及其制备方法和和应用。
技术介绍
近年来，肿瘤的个体化治疗基因检测已在临床广泛应用，通过检测肿瘤患者生物样本中生物标志物的基因的核苷酸多态性、插入或缺失和拷贝数变异来预测药物疗效和评价预后，指导临床个体化治疗。但是由于检测及分析方法的不同存在检测出假阳性和假阴性的风险，例如下一代测序(NextGenerationSequencing，NGS)，检测灵敏度和测序深度相关，一般来说，NGS在肿瘤体细胞突变检测时，检测灵敏度为10％，已知的与肿瘤相关驱动基因数量有限，疾病表型和基因型的关系还有赖于生物信息的解读，而目前NGS应用于肿瘤细胞突变检测的标准化和质量控制尚未形成共识。扩增阻碍突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS)是PCR技术应用的发展，也称等位基因特性PCR(allele-specificPCR，AS-PCR)等只能检测已知的突变类型，不能发现一些新的、未知的突变，如果检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种泛肿瘤基因检测的标准品，所述标准品含有13种经修饰的细胞系的基因组DNA，其质量份数配比如下表：/n

【技术特征摘要】
1.一种泛肿瘤基因检测的标准品，所述标准品含有13种经修饰的细胞系的基因组DNA，其质量份数配比如下表：





2.一种泛肿瘤基因检测标准品的制备方法，包括如下步骤：
(1)选择肿瘤细胞系进行基因编辑：
a、针对目标基因的目标位点，设计特异的gRNA，并构建gRNA的表达载体，设计并合成单链DNA，用作基因编辑修复的模板；
b、将gRNA的表达载体和单链DNA共转染至目标细胞；
c、待细胞状态良好时，将其进行单细胞克隆；
d、细胞克隆形成后，取部分克隆进行测序，确定基因编辑成功；
(2)gDNA提取：采用试剂盒进行gDNA提取；
(3)DNA浓度测定：
使用分光光度计对提取的产物进行DNA浓度的测定，浓度测定，应当连续进行重复检测，应满足如下条件：
浓度：平均浓度20.0ng/μL≤x≤60.0ng/μL；
OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格；
OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格；
(4)混合和稀释
①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合，混合前需确认：
待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的；
待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格；
②选择合适体积的管子进行混合；
③测定混合后的浓度及OD值；
④稀释：混合后进行浓度测定，目标稀释浓度为20-60ng/μL；
(5)混合：经过质检合格的gDNA依照下表所示的特定质量份数进行混合，获得泛肿瘤基因检测标准品待检测样品：



(6)检测及测序分析：经过上述步骤(5)所述混合后的所述待检测样品通过ddPCR检测及全外显子高通量测序分析，合格后获得泛肿瘤基因检测标准品。


3.根据权利要求1所述的标准品或权利要求2所述的方法，所述细胞系为KBM-7，所述修饰为基因编辑；较佳地，所述基因包括肿瘤相关基因；更佳地，所述基因包括EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、HER2、ALK、KIT、FLT3、PIK3CA等。


4.根据权利要求2或3所述的方法，所述步骤c中，所述单细胞克隆的方法包括如下步骤：
C1.待细胞的汇合度达到70％～90％时，消化并收集细胞；
C2.对细胞计数，按照倍比稀释的方法，用培养基将活细胞稀释至5个/mL，并将细胞混匀；
C3.取10mL细胞悬液，均匀分到一块96孔板中；
C4.待细胞克隆形成时，标记有克隆的孔，加入少量胰蛋白酶消化细胞，取部分细胞进行PCR，用作测序，剩余细胞继续培养。


5.根据权利要求2或3所述的方法，所述步骤(6)中所述ddPCR检测对下表中的基因位点中的一种或多种进行基因频率的检测：








6.根据权利要求2或3所述的方法，所述步骤(6)中所述ddPCR检测过程中采用的引物和/或探针选自下表中一种或多种：








7.根据权利要求2或3所述的方法，所述步骤(6)中所述ddPCR的检测步骤包括如下：
①配置反应的预混液如下：



②微滴发生：将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中，微滴生成油加入到卡的下排孔位中，在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套，将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内，并关闭盖子，等待微滴生成完成；
③微滴转移：用移液枪将生成的微滴转移到96孔PCR反应板内，将枪头的位置保持在一定倾斜度角防止卡的底部阻塞枪头；
④封膜：当所有样品的微滴转移完成以后，放置一片铝膜置于96孔板的表面，用热封仪进行封膜；
⑤PCR：将96孔板放置于PCR仪上，并关紧盖子，仪器升降温速度调到2-3℃/s，按照如下程序运行：



⑥信号收集：当PCR程序完成，将96孔板转移到QX200微滴读取仪上，在电脑上，打开“QuantaSoft”软件，并选择包含样品的孔，在相应的位置进行设置；
⑦数据分析：当数据读取完成以后，打开要分析的实验数据，选择“Analyze”对结果进行分析。


8.根据权利要求2或3所述的方法，所述步骤(6)中所述全外显子高通量测序分析包括如下步骤：
①数据质控：使用Fastp对低质量的数据进行过滤；
②比对参考基因组：使用BWA比对参考基因组；
③数据处理：数据使用samtools和gencore进行sort和去除duplicate；
④变异检测：使用VarScan2；
⑤突变注释：使用ANNOVAR对突变进行注释；
⑥突变过滤及突变频率计算：所述高通量测序所检测基因选自下表：














GRIN2A
NCOR2
PTPRT
CSF3R
CDH5
PMS2
DEK
IRF2


TRRAP
GLI2
PHOX2B
PAX5
CDH11
BRIP1
RNASEL
KLHL6


DPYD
TRIM33
RRM1
CDKN1A
RPS6KA4
FANCL
TPMT
FGFR3


BLNK
LAMP1
FOXP4
SLX4
AXIN2
ERBB3
FLT4
GEN1


TMEM127
CSMD3
MKL1
SRC
BCL11A
RNF43
GID4
FGFR4


MAML2
SMC3
THBS1
NFKBIA
CDH20
MAP3K1
DDX41
SDHB


EPHA7
BCL2L11
PLCG1
FANCE
GLI1
EGFR
NSD1
SPEN


CHD2
SH2B3
top2A
NUTM1
PLK2
PDGFRA
RPS6KA2
NTRK1


SAMD9
RANBP2
SOX10
BRCA2
NUP93
AURKA
PBX1
PTPRO

【专利技术属性】
技术研发人员：韦良慎，李菁华，梁达超，林东旭，魏孝林，
申请(专利权)人：菁良基因科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44