一种同源重组修复缺陷参考品及其制备方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种同源重组修复缺陷参考品及其制备方法和试剂盒，所述参考品以10对配对细胞系提取的基因组DNA按照一定比例混合而成，并通过全基因组测序对梯度参考品进行测序，经过特定的生物信息算法计算出相应梯度参考品的同源重组修复缺陷值；而检测限参考品则通过使用配对样品中的正常细胞样品稀释肿瘤细胞样品，并使用微滴式数字PCR的方法验证稀释比例，确保混合符合预期，以此最大程度模拟临床样品的复杂性及检验检测系统的特异及灵敏性；本参考品可以用于同源重组修复缺陷检测产品的性能评价，也可以用于同源重组修复缺陷的算法优化或检测流程优化，适用于高通量中的核苷酸多态性基因芯片、靶向基因组或全基因组的测序策略。

【技术实现步骤摘要】
一种同源重组修复缺陷参考品及其制备方法和试剂盒
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种同源重组修复缺陷参考品及其制备方法和试剂盒。
技术介绍
近年来，受国家政策的大力推动和技术的不断更替，分子诊断尤其是基因检测领域发展极为迅速，基因检测涉及无创产前检测、肿瘤易感预测、肿瘤早期诊断、个体化用药、术后监测以及消费型基因检测等。由于市场容量巨大，近年来，市场上出现了越来越多的此类基因检测的试剂盒。同源重组修复缺陷（Homologousrecombinationdeficiency，HRD）作为一个潜在的生物标志物出现，业内公司争相推出相关检测。同源重组修复缺陷定义为一份肿瘤样本中，基因组中杂合性缺失（LOH）、端粒等位基因不平衡（TAI）以及大片段迁移（LST）事件的次数之和或加权之和。HRD检测的临床意义主要体现在风险评估、预后判断、指导治疗三个方面。在PRIMA研究中凸显出HRD检测对指导卵巢癌治疗的重要作用，尼拉帕利单药一线维持治疗超半数HRD+患者显著获益。基于PRIMA的研究结果，2020版《NCCN卵巢癌指南》将尼拉帕利纳入一线维持治疗的推荐，另外HRD在乳腺癌及前列腺癌都有作为用药标志物的潜力。但是如何准确报告同源重组修复缺陷是一直困扰相关检测行业的一大难题。目前HRD检测经过临床验证且获FDA批准的有两个产品，MyriadHRD和FoundationFoucusTMCDxBRCALOH，分别检测组织BRCA1/2和LOH、LST、TAI及血液gBRCA1/2基因突变和gLOH，国内相关企业也在着手研发对应的检测试剂盒，从检测手段来看，分别有使用panel测序和基因芯片方法进行的检测；从受检样品来看，既有组织也有血液。目前针对HRD的检测存在诸多争议，比如应该选择靶向基因组还是核苷酸多态性基因芯片来进行HRD的计算，LOH、TAI和LST的各类事件是否应进行统一定义及合成计算，不同样品的类型、处理方法和不同的生物信息学算法也影响HRD值。除此之外，在实验部分分析流程的差异也有可能导致结果的偏差。如何在各种影响检测结果的因素中准确地报告HRD值一直困扰着许多检测试剂盒开发厂家。目前市面上并没有较为合适同源重组修复相关的参考品去帮助厂家校准或监测HRD的检测流程，HRD检测亟需一个标准化的参考品去校准及优化。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术的一个目的在于提供一种同源重组修复缺陷（HRD）检测的参考品，所述参考含有如下10对配对细胞系的基因组DNA（genomicDNA，gDNA）：其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述十对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞；所述的参考品包含同源重组修复缺陷梯度参考品、检测限参考品、重复性参考品。参考品需要最大限度模拟临床样本的实际情况，因为临床取样的样本不会是100%的肿瘤细胞，因此本专利技术的参考品将肿瘤细胞与正常配对细胞按照不同比例进行混合，以最大限度模拟临床样品客观情况。所述同源重组修复缺陷梯度参考品的同源重组修复缺陷检测值为29~103，由所述10对配对细胞系的基因组DNA组成：GW-P7-T和GW-P7-N、GW-P8-T和GW-P8-N、GW-P9-T和GW-P9-N、GW-P10-T和GW-P10-N、GW-P11-T和GW-P11-N、GW-P12-T和GW-P12-N、GW-P13-T和GW-P13-N、GW-P14-T和GW-P14-N、GW-P15-T和GW-P15-N、GW-P16-T和GW-P16-N。所述检测限参考品和/或重复性参考品的所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为90%~10%，总体积为1，由所述10对配对细胞系的基因组DNA组成：GW-P7-T和GW-P7-N、GW-P8-T和GW-P8-N、GW-P9-T和GW-P9-N、GW-P10-T和GW-P10-N、GW-P11-T和GW-P11-N、GW-P12-T和GW-P12-N、GW-P13-T和GW-P13-N、GW-P14-T和GW-P14-N、GW-P15-T和GW-P15-N、GW-P16-T和GW-P16-N。本专利技术的另一个目的在于提供一种重组修复缺陷梯度参考品的制备方法，包括如下步骤：（1）筛选配对细胞系选择如下GW-P7~GW-P16的十对配对细胞系：其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述十对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞；（2）每株细胞系首先进行STR分型鉴定，以确认细胞类型符合预期；然后，提取gDNA；（3）DNA浓度测定使用分光光度计对提取的gDNA产物进行DNA浓度的测定，应当连续进行3次重复检测，应满足如下条件：浓度：平均浓度20.0ng/μL≤x≤60.0ng/μL；OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格；OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格。（4）混合和稀释①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合，混合前需确认：待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的；待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格；②选择合适体积的管子进行混合；③测定混合后的浓度及OD值；④稀释：混合后进行浓度测定，目标稀释浓度为25ng/μL；（5）配对细胞系的混合和质检，将上述10对细胞系的基因组DNA按照不同体积比例进行混合，根据高通量全基因组测序数据的分析结果，每一对细胞挑选一个突变位点设计特异性的探针和引物，基因突变位点、引物和探针的序列信息如下表所示：基因突变位点：引物序列：探针序列：采用微滴式数字PCR对原材料原始的突变频率进行确认；（6）参考品同源重组修复缺陷值检测和计算。进一步的，所述步骤（5）中所述混合的比例为所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为90%~10%，总体积为1。进一步的，所述同源重组修复缺陷参考品包含同源重组修复缺陷梯度参考品、检测限参考品及重复性参考品；所述同源重组修复缺陷梯度参考品的同源重组修复缺陷检测值为29~103；所述检测限参考品和/或重复性参考品的GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为90%~10%，总体积为1。进一步的，所述步骤（5）中所述微滴式数字PCR的检测步骤包括如下：①配置反应的预混液如下：②微滴发生：将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中，微滴生成油加入到卡的下排孔位中，在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套，将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同源重组修复缺陷参考品，其特征在于，所述参考品由十对配对细胞系的基因组DNA组成：/n细胞系编号GW-P7-T：细胞系名称NCI-H1770；/n细胞系编号GW-P7-N：细胞系名称NCI-BL1770；/n细胞系编号GW-P8-T：细胞系名称NCI-H1184；/n细胞系编号GW-P8-N：细胞系名称NCI-BL1184；/n细胞系编号GW-P9-T：细胞系名称NCI-H128；/n细胞系编号GW-P9-N：细胞系名称NCI-BL128；/n细胞系编号GW-P10-T：细胞系名称NCI-H2171；/n细胞系编号GW-P10-N：细胞系名称NCI-BL2171；/n细胞系编号GW-P11-T：细胞系名称HCC1937；/n细胞系编号GW-P11-N：细胞系名称HCC1937BL；/n细胞系编号GW-P12-T：细胞系名称COLO 829；/n细胞系编号GW-P12-N：细胞系名称COLO 829BL；/n细胞系编号GW-P13-T：细胞系名称NCI-H209；/n细胞系编号GW-P13-N：细胞系名称NCI-BL209；/n细胞系编号GW-P14-T：细胞系名称HCC1954；/n细胞系编号GW-P14-N：细胞系名称HCC1954 BL；/n细胞系编号GW-P15-T：细胞系名称HCC1187；/n细胞系编号GW-P15-N：细胞系名称HCC1187 BL；/n细胞系编号GW-P16-T：细胞系名称HCC1395；/n细胞系编号GW-P16-N：细胞系名称HCC1395 BL；/n其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述十对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞；/n所述的参考品包含同源重组修复缺陷梯度参考品、检测限参考品、重复性参考品。/n...

【技术特征摘要】
1.一种同源重组修复缺陷参考品，其特征在于，所述参考品由十对配对细胞系的基因组DNA组成：
细胞系编号GW-P7-T：细胞系名称NCI-H1770；
细胞系编号GW-P7-N：细胞系名称NCI-BL1770；
细胞系编号GW-P8-T：细胞系名称NCI-H1184；
细胞系编号GW-P8-N：细胞系名称NCI-BL1184；
细胞系编号GW-P9-T：细胞系名称NCI-H128；
细胞系编号GW-P9-N：细胞系名称NCI-BL128；
细胞系编号GW-P10-T：细胞系名称NCI-H2171；
细胞系编号GW-P10-N：细胞系名称NCI-BL2171；
细胞系编号GW-P11-T：细胞系名称HCC1937；
细胞系编号GW-P11-N：细胞系名称HCC1937BL；
细胞系编号GW-P12-T：细胞系名称COLO829；
细胞系编号GW-P12-N：细胞系名称COLO829BL；
细胞系编号GW-P13-T：细胞系名称NCI-H209；
细胞系编号GW-P13-N：细胞系名称NCI-BL209；
细胞系编号GW-P14-T：细胞系名称HCC1954；
细胞系编号GW-P14-N：细胞系名称HCC1954BL；
细胞系编号GW-P15-T：细胞系名称HCC1187；
细胞系编号GW-P15-N：细胞系名称HCC1187BL；
细胞系编号GW-P16-T：细胞系名称HCC1395；
细胞系编号GW-P16-N：细胞系名称HCC1395BL；
其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述十对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞；
所述的参考品包含同源重组修复缺陷梯度参考品、检测限参考品、重复性参考品。


2.根据权利要求1所述的同源重组修复缺陷参考品，其特征在于，所述同源重组修复缺陷梯度参考品的同源重组修复缺陷检测值为29~103，由所述10对配对细胞系的基因组DNA组成：GW-P7-T和GW-P7-N、GW-P8-T和GW-P8-N、GW-P9-T和GW-P9-N、GW-P10-T和GW-P10-N、GW-P11-T和GW-P11-N、GW-P12-T和GW-P12-N、GW-P13-T和GW-P13-N、GW-P14-T和GW-P14-N、GW-P15-T和GW-P15-N、GW-P16-T和GW-P16-N。


3.根据权利要求1所述的同源重组修复缺陷参考品，其特征在于，所述检测限参考品和/或重复性参考品的所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为90%~10%，总体积为1，由所述10对配对细胞系的基因组DNA组成：GW-P7-T和GW-P7-N、GW-P8-T和GW-P8-N、GW-P9-T和GW-P9-N、GW-P10-T和GW-P10-N、GW-P11-T和GW-P11-N、GW-P12-T和GW-P12-N、GW-P13-T和GW-P13-N、GW-P14-T和GW-P14-N、GW-P15-T和GW-P15-N、GW-P16-T和GW-P16-N。


4.一种同源重组修复缺陷参考品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）筛选配对细胞系
选择如下GW-P7~GW-P16的十对配对细胞系：
细胞系编号GW-P7-T：细胞系名称NCI-H1770；
细胞系编号GW-P7-N：细胞系名称NCI-BL1770；
细胞系编号GW-P8-T：细胞系名称NCI-H1184；
细胞系编号GW-P8-N：细胞系名称NCI-BL1184；
细胞系编号GW-P9-T：细胞系名称NCI-H128；
细胞系编号GW-P9-N：细胞系名称NCI-BL128；
细胞系编号GW-P10-T：细胞系名称NCI-H2171；
细胞系编号GW-P10-N：细胞系名称NCI-BL2171；
细胞系编号GW-P11-T：细胞系名称HCC1937；
细胞系编号GW-P11-...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦良慎，梁达超，邱凯，魏孝林，刘亚胜，明炳玉，张秀芝，李培培，
申请(专利权)人：菁良基因科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44