一种毛竹寡核苷酸探针及其获得方法和使用方法技术

本发明专利技术公开一种毛竹寡核苷酸探针，包括9种探针中一种或多种，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1‑9所示。本发明专利技术还公开其获得方法和使用方法。本发明专利技术首先利用已发表毛竹基因组测序数据，利用生物信息学方法分析毛竹基因组中重复序列，开发毛竹寡核苷酸探针，同时利用SSR和端粒序列开发毛竹寡核苷酸探针。然后利用新开发的寡核苷酸探针对毛竹及17个近缘竹属竹种染色体组分析，构建毛竹及其近缘种高清FISH核型，目的是建立经济高效且通用性强的毛竹细胞学标记设计技术与染色体识别技术，丰富竹类植物染色体标记，从细胞遗传学角度分析毛竹及其近缘野生种的基因组类型，同时对一些竹种染色体结构变异进行鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种毛竹寡核苷酸探针及其获得方法和使用方法
本专利技术涉及寡核苷酸探针
，具体涉及一种毛竹寡核苷酸探针及其获得方法和使用方法。
技术介绍
竹类植物是世界上生长最快的植物，具有重要的经济、生态和文化价值，其笋可以食用，茎秆可以加工成竹地板、竹席、竹炭及各类竹工艺品等，竹类植物四季常绿，是园林绿化及山地造林的重要植物。据不完全统计，全世界约25亿人经济来源依靠竹类植物，竹类植物贸易总额，每年约25亿美元。全世界竹类植物约有1500个种，可分为温带木本竹种(temperatewoodybamboos)、新热带木本竹种(neotropicalwoodybamboos)、古热带木本竹种(palaeotropicalwoodybamboos)和草本竹种(tribeOlyreae)四种类型，其中温带木本竹种染色体数目为2n＝46-48，新热带木本竹种染色体数目为2n＝40-48，古热带木本竹种染色体数目为2n＝70-72，草本竹种染色体数目为2n＝22-24。根据一些竹种的染色体数目表现，一些研究者推测，竹类植物染色体基数为X＝12，其中温带木本竹种(2n＝46-48)和新热带木本竹种(2n＝40-48)为4倍体，古热带木本竹种(2n＝70-72)为6倍体。后来一些研究者发现还有一些竹种染色体数目为2n＝64；96及104，如果以染色体基数为X＝12推算，染色体数目为2n＝64及104的竹种倍性无法确定，因此推测竹类植物染色体基数可能为X＝8，而不是X＝12。为了对竹类植物基因组类型及演化历史有更清晰的认识，一些研究者选择了两个二倍体竹种Olyralatifolia(Ola)(2n＝22)和Raddiaguianensis(Rgu)(2n＝22)、一个四倍体竹种Guaduaangustifolia(2n＝4x＝46)和一个六倍体竹种Boniaamplexicaulis(2n＝6x＝72)3种不同倍性的竹种进行了测序分析，根据这些竹种的基因组测序数据，对竹类植物基因组演化历史进行了揭示，推测大约在4.2亿年前，木本竹种从草本竹种中分化出来，并快速形成A、B、C、D四个不同的亚基因组，在后期进化过程中，B基因组与C基因组竹种杂交产生了基因组类型为BBCC的新热带木本竹种，C基因组与D基因组竹种杂交，形成了基因组为CCDD的温带木本竹种，后来又经过漫长的进化，A基因组竹种与基因组为BBCC的新热带木本竹种杂交，形成了染色体组类型为AABBCC的异源六倍体热带木本竹种。毛竹染色体数目为2n＝48，为温带木本竹种，根据上面分子系统学研究结果，其基因组类型应为CCDD，但毛竹(Phyllostachysedulis(Carrière)J.Houz.)测序结果显示，其是一个二倍体竹种，与以上染色体组分类系统不完全吻合。在整个竹类植物中，温带木本竹种在数量上占有绝对优势，这些温带木本竹种在基因组类型上是否存在差异？另外，竹类植物是一种兼性生殖植物，即可通过有性生殖繁殖后代，也可通过无性生殖扩大群体，这种特殊的繁殖方式为竹类植物保存各种遗传变异提供了良好的条件。竹类植物中目前存在着大量的变种及变型，这些变种及变型间在染色体结构上是否存在差异？目前仅靠少数几个竹种的测序结果还无法对这些问题进行有效揭示。在植物基因组结构研究中，荧光原位杂交技术是一项非常有用的细胞遗传学技术，借助一些探针在染色体上的物理分布，可对植物染色体结构、染色体组类型、染色体核型及外源染色体等进行精细分析和鉴定。利用荧光原位杂交技术分析植物染色体的前提条件是有合适和充足的荧光探针，也即染色体物理标记。然而，目前竹类植物染色体物理标记非常匮乏，除了45SrDNA外，几乎没有可用的染色体物理标记，目前仅有45SrDNA在毛竹、斑竹(Phyllostachysbambusoidesf.lacrima-deae)、龟甲竹(Phyllostachysheterocycla(Carr.)Mitford)、茶秆竹(Pseudoasaamabilisvar.amabilis)、菲白竹(Sasafortunei)、日本矮竹(Sasapygmea)、铺地竹(Sasaargenteastriatus)及白绿竹(Bambusaoldhamii(W))等8个竹种染色体上的分布特点的报道，大部分竹种的细胞遗传学工作还停留在染色体计数或传统的核型分析等初级细胞遗传学研究水平，这些研究仅能揭示竹类植物染色体数目及形态大小等信息，并不能对竹类植物染色体组类型及染色体结构变异等进行有效分析。竹类植物属于小染色体物种，染色体数目不仅多，而且染色体形态非常小，有些染色体甚至呈点状，部分染色体个体在形态及大小上也非常相似，因此如果没有相应的染色体物理标记作辅助，很难对竹类植物染色体结构变异及染色体组类型等进行精细分析和鉴定。可以说竹类植物染色体物理标记缺乏已成为制约竹类植物细胞遗传学发展的技术瓶颈。寡核苷酸荧光原位杂交技术是一种以单链寡核苷酸为探针的新型荧光原位杂交技术，这些寡核苷酸探针是一种新型的染色体物理标记，可从已测序物种的基因组中开发。另外，与传统的BAC-FISH技术相比，寡核苷酸荧光原位杂交技术省去了质粒DNA扩繁、提取及探针标记等繁琐步骤，而且实验更加简化和高效。目前毛竹全基因组测序工作已经完成，其基因组大小约2.05Gb，其中转座元件类型的重复序列约占整个基因组的59％，显示毛竹重复序列寡核苷酸探针具有很大的开发空间。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题：本专利技术首次为竹类植物设计一种经济高效且通用性强的寡核苷酸探针，并首次建立竹类植物寡核苷酸荧光原位杂交技术体系，填补竹类植物染色体物理标记为零的空白；并应用新设计的寡核苷酸探针对包括毛竹在内的18个竹种基因组进行分析，建立毛竹及其近缘种龟甲竹、花毛竹、黄竿乌哺竹、斑竹、高节竹、紫竹、四季竹、金镶玉竹、白哺鸡竹及雷竹等11个竹种的高清FISH核型。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：本专利技术第一方面提供了一种毛竹寡核苷酸探针，其包括9种探针中的一种或多种，9种探针的核苷酸序列如下：探针OligoMZ-DL-3，如SEQIDNO:1所示：TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG；探针OligoMZ-5S-1，如SEQIDNO:2所示：ATGGAGAGCATGAGGTTGGGGACGGAGGGGAGTTAAGGGG；探针OligoBa-14，如SEQIDNO:3所示：TCAACAAGGGGGAGGTCTGAGCGGCTAAGATCTCCAGAGAGGAGGTCCTAACG；探针OligoMZ-CL22-1，如SEQIDNO:4所示：AATAATTCCGAGCAGGTGTGAAACTTTCCAGAACGA；探针OligoMZ-CL22-2，如SEQIDNO:5所示：TATGAAATCGAGGCACGGAAAGAAAATCAACACCAAACAC；探针OligoBa-131X-1，如SEQIDNO:6所示：GTAGGGCACACTAGAAGTCCATTATGGGTGTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毛竹寡核苷酸探针，其特征在于，其包括9种探针中的一种或多种，9种探针的核苷酸序列如下：/n探针Oligo MZ-DL-3，如SEQ ID NO:1所示：TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG；/n探针Oligo MZ-5S-1，如SEQ ID NO:2所示：ATGGAGAGCATGAGGTTGGGGACGGAGGGGAGTTAAGGGG；/n探针Oligo Ba-14，如SEQ ID NO:3所示：TCAACAAGGGGGAGGTCTGAGCGGCTAAGATCTCCAGAGAGGAGGTCCTAACG；/n探针Oligo MZ-CL22-1，如SEQ ID NO:4所示：AATAATTCCGAGCAGGTGTGAAACTTTCCAGAACGA；/n探针Oligo MZ-CL22-2，如SEQ ID NO:5所示：TATGAAATCGAGGCACGGAAAGAAAATCAACACCAAACAC；/n探针Oligo Ba-131X-1，如SEQ ID NO:6所示：GTAGGGCACACTAGAAGTCCATTATGGGTGTTTGGTATTGATTTTCTTTCCGTGCCTC；/n探针Oligo Ba-131X-2，如SEQ ID NO:7所示：GATTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACGCGTCGTTCTGGAAAGTTTCACACCGGCTCGG；/n探针Oligo Ba-131X-3，如SEQ ID NO:8所示：AAAGATTCCAAATGCACCTAGAAATGACTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACCCGT；/n探针Oligo Ba-131X-4，如SEQ ID NO:9所示：CGTTCTGGAAAGTTTCACACCTGCTCGGAATTATTCCAAATGCACCTAGAAATGAC。/n...

【技术特征摘要】
1.一种毛竹寡核苷酸探针，其特征在于，其包括9种探针中的一种或多种，9种探针的核苷酸序列如下：
探针OligoMZ-DL-3，如SEQIDNO:1所示：TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG；
探针OligoMZ-5S-1，如SEQIDNO:2所示：ATGGAGAGCATGAGGTTGGGGACGGAGGGGAGTTAAGGGG；
探针OligoBa-14，如SEQIDNO:3所示：TCAACAAGGGGGAGGTCTGAGCGGCTAAGATCTCCAGAGAGGAGGTCCTAACG；
探针OligoMZ-CL22-1，如SEQIDNO:4所示：AATAATTCCGAGCAGGTGTGAAACTTTCCAGAACGA；
探针OligoMZ-CL22-2，如SEQIDNO:5所示：TATGAAATCGAGGCACGGAAAGAAAATCAACACCAAACAC；
探针OligoBa-131X-1，如SEQIDNO:6所示：GTAGGGCACACTAGAAGTCCATTATGGGTGTTTGGTATTGATTTTCTTTCCGTGCCTC；
探针OligoBa-131X-2，如SEQIDNO:7所示：GATTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACGCGTCGTTCTGGAAAGTTTCACACCGGCTCGG；
探针OligoBa-131X-3，如SEQIDNO:8所示：AAAGATTCCAAATGCACCTAGAAATGACTTCATAAAGTGGAGCTCAGGGTACCCGT；
探针OligoBa-131X-4，如SEQIDNO:9所示：CGTTCTGGAAAGTTTCACACCTGCTCGGAATTATTCCAAATGCACCTAGAAATGAC。


2.根据权利要求1所述的毛竹寡核苷酸探针，其特征在于，每条探针5'端均标记荧光基团。


3.一种如权利要求1或2所述的毛竹寡核苷酸探针的获得方法，其特征在于，包括以下方式：
方式一：
OligoBa-14、OligoMZ-CL22-1、OligoMZ-CL22-2、OligoBa-131X-1、OligoBa-131X-2、OligoBa-131X-3和OligoBa-131X-4是通过对毛竹全基因组测序数据进行生物信息学分析设计获得：登录(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6204424/#sup1)网站，下载毛竹测序数据，然后利用CD-HITSuite(http://weizhong-lab.ucsd.edu/cdhit_suite/cgi-bin/index.cgi？cmd＝cd-hit)、DNAMAN(http://www.lynnon.com)和RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org/)寻找全部重复序列，按照periodsize(>4)，copynumber(>100)，periodsize×copynumber>3000条件筛选出有效重复序列，按拷贝数从多到少排列，从中设计了80条寡核苷酸序列，合成相应的寡核苷酸探针，然后利用毛竹中期染色体制片对这80条探针进行荧光原位杂交筛选，发现OligoBa-14，OligoMZ-CL22-1，OligoMZ-CL22-2，OligoBa-131X...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐川梅，黄坚钦，王子含，金旭胤，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33