用于基因组编辑和调节转录的CRISPR/CAS系统和方法技术方案

提供了一种用于编辑或调节细胞基因组转录的CRISPR/Cas系统和方法，其中所述系统包括与一个或多个降解决定子序列融合的Cas核酸内切酶和至少一个可激活的同源单向导RNA，所述同源单向导RNA在所述同源sgRNA的非必需区域中带有失活序列，其中所述失活序列包含例如核酶的一个或多个核酸内切酶识别位点。

CRISPR / CAS system and methods for genome editing and transcription regulation

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因组编辑和调节转录的CRISPR/CAS系统和方法引言本申请要求2017年9月26日提交的美国临时申请号62/563,128；2017年9月26日提交的美国临时申请号62/563,131；和2017年9月26日提交的美国临时申请号62/563,133的优先权权益，这些美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。本专利技术是在政府支持下根据由国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的基金号R01HD081534作出的。政府拥有本专利技术的某些权利。
技术介绍
在使用哺乳动物细胞的早期研究中，发现使用归巢核酸内切酶I-SceI在基因组中的独特位置处引入DNA双链断裂(DSB)会通过同源重组而刺激基因靶向。随后，已经使用人工序列特异性核酸酶(如锌指核酸酶和TALE核酸酶)和最近的RNA引导的成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)(CRISPR/Cas)核酸酶来靶向预定的基因组位点。在CRISPR/Cas9的情况下，具有与靶DNA互补的间隔区序列的单向导RNA(sgRNA或gRNA)引导Cas9核酸内切酶对DNA的切割。在DSB修复期间发生基因组序列的修饰，并且起作用的分子途径决定了序列变化的类型。规范的非同源末端连接(NHEJ)和诸如微同源介导的末端连接(MMEJ)的替代的末端连接途径在DNA末端已经被加工之后通过连接所述DNA末端而进行，并且引起靶向但不精确的插入缺失(一般是小的插入或缺失)。两个或更多个核苷酸的微同源性可以在DNA切割之后通过切除而暴露并且可以在通过MMEJ进行修复期间使用。与末端连接途径相反，使用外源性DNA修复模板的同源性依赖性修复(HDR)支持精确的基因组编辑。通常，可以使用具有与侧接DSB的序列同源的臂的转基因并且所述转基因因此将被精确地整合。限制基于CRISPR/Cas9的基因组编辑的效率的障碍有非编码区或弱转录基因的存在，它们对于CRISPR/Cas9诱变来说似乎是难处理的；以及相对于NHEJ修复，HDR的频率较低，这使得难以对基因组序列产生精确的变化。为了增强通过HDR进行的基因组编辑，已经开发了不同的策略。例如，当将细胞在S/G2期同步化时，通过同源重组进行DNA修复的细胞周期被限制，并且HDR可以增加到高达五倍。例如在连接酶4失活后的NHEJ抑制也可以增加HDR。另一种方法是将规范的Cdh1或Cdc20降解决定子(如联会蛋白降解决定子)与Cas9融合以诱导它在G1中降解并且将靶DNA切割限制到S/G2期(Gutschner等,(2016)CellRep.14:1555-1566；Maji等,(2017)Nat.Chem.Biol.13:9-11；Howden等,(2016)StemCellRep.7:508-517)。还参见WO2017/024047A1、US2016/0376610和CN105647885B。类似地，已经将PEST降解决定子与Cas9融合以缩短Cas9的半衰期(CN201410656081)。当前的CRISPR方法的另一个限制是当Cas9和它的sgRNA共表达时的组成型核酸内切酶活性。这在靶向在发育上对于活力来说重要的或必要的基因时可特别成问题。此外，已经证实，Cas9的组成型表达可增加脱靶突变的数量并且可触发DNA损伤响应。解决该问题的一种方法是将FKBP12衍生的去稳定化结构域与Cas9融合，这会有条件地调节蛋白质稳定性(Senturk等,(2017)Nat.Commun.8:14370；US2016/0298096)。当表达多个sgRNA时，可以引导Cas9以同时操纵多个基因组基因座，这可以通过在单独的构建体中共转染多个sgRNA而实现。尽管这种方法是高效的，但是对于其中载体容量和/或载体数量对于同时产生多个gRNA是有限的某些应用来说，它将是一个挑战。已经开发了几种策略来从单个转录物表达多个gRNA。一种策略使用Csy4核糖核酸内切酶，其可以加工含有与Csy4可切割的RNA融合的gRNA的转录物(Nissim等,(2014)Mol.Cell.54:698-710；Tsai等,(2014)Nat.Biotechnol.32:569-576)。此外，已经使用自切割核酶在U6启动子的控制下从单个表达盒表达多个sgRNA(Xu等,(2017)Nucl.AcidsRes.45(5):e28)。
技术实现思路
本专利技术提供了一种CRISPR/Cas系统，其包括Cas核酸内切酶和同源单向导RNA(sgRNA)，其中：(a)所述Cas核酸内切酶与一个或多个降解决定子序列融合，其中所述降解决定子具有(i)非规范的Cdc20或Chd1识别基序，或(ii)由连接酶靶向的序列，所述连接酶选自EMI1、TRP1、CBL-PTK、CBL-MET、COP1、CRL4-CDT2、KelchKEAP1、KelchKLHL3、MDM2-SWIB、ODPH-VHL、SCF-SKP2、SCF-SKP2-CKS1、SCF-CULLIN、SCF-FBW7、SCF-FBX05、SCF-TRCP1、SCF-CUL4、E6-AP、SIAH、HECT结构域家族、环指家族(RINGfingerfamily)、U框家族(Uboxfamily)和其组合；(b)所述同源sgRNA是可激活的sgRNA，其在所述可激活的sgRNA的非必需区域中带有失活序列，其中所述失活序列包含一个或多个核酸内切酶识别位点；或(c)(a)和(b)的组合。在一些实施方式中，所述系统包括可激活的sgRNA的阵列，其中所述同源sgRNA靶向所述可激活的sgRNA的阵列中的至少一个可激活的sgRNA。在所述Cas融合蛋白的某些方面，所述Cas核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。在所述Cas融合蛋白的一些实施方式中，所述一个或多个降解决定子序列与所述Cas核酸内切酶融合，在它们之间设置有一个或多个接头。在所述Cas融合蛋白的其它实施方式中，所述一个或多个降解决定子序列在所述Cas核酸内切酶的N末端、C末端或N末端和C末端处与所述Cas核酸内切酶融合。在所述可激活的sgRNA的某些方面，所述可激活的sgRNA靶向核酸分子的转录链。在所述可激活的sgRNA的其它方面，所述失活序列是顺式作用核酶。在一些实施方式中，所述顺式作用核酶由SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的核酸分子编码。在其它实施方式中，所述可激活的sgRNA由SEQIDNO:14-22的核酸分子编码。还包括一种核酸，所述核酸具有编码序列、5'非翻译区和3'非翻译区，其中所述核酸在5'非翻译区或3'非翻译区中插入有可激活的sgRNA。还提供了编码所述Cas融合蛋白和/或可激活的sgRNA的多核苷酸和载体，以及一种使用所述CRISPR/Cas系统以通过将所述Cas融合蛋白和/或可激活的sgRNA引入到细胞中来编辑或调节细胞的基因组的转录的方法。当用于本专利技术的方法中时，可以通过一种或多种可调节的启动子来控制Cas核酸内切酶、可激活的sgRNA或Cas核酸内切酶和可激活的sgRNA的表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CRISPR/Cas系统，其包含Cas核酸内切酶和同源单向导RNA(sgRNA)，其中：/n(a)所述Cas核酸内切酶与一个或多个降解决定子序列融合，其中所述降解决定子具有：/n(i)非规范的Cdc20或Chd1识别基序，或/n(ii)由连接酶靶向的序列，所述连接酶选自EMI1、TRP1、CBL-PTK、CBL-MET、COP1、CRL4-CDT2、Kelch KEAP1、Kelch KLHL3、MDM2-SWIB、ODPH-VHL、SCF-SKP2、SCF-SKP2-CKS1、SCF-CULLIN、SCF-FBW7、SCF-FBX05、SCF-TRCP1、SCF-CUL4、E6-AP、SIAH、HECT结构域家族、环指家族、U框家族和其组合；/n(b)所述同源sgRNA是可激活的sgRNA，其在所述可激活的sgRNA的非必需区域中带有失活序列，其中所述失活序列包含一个或多个核酸内切酶识别位点；或/n(c)(a)和(b)的组合。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170926 US 62/563,131;20170926 US 62/563,133;20171.一种CRISPR/Cas系统，其包含Cas核酸内切酶和同源单向导RNA(sgRNA)，其中：
(a)所述Cas核酸内切酶与一个或多个降解决定子序列融合，其中所述降解决定子具有：
(i)非规范的Cdc20或Chd1识别基序，或
(ii)由连接酶靶向的序列，所述连接酶选自EMI1、TRP1、CBL-PTK、CBL-MET、COP1、CRL4-CDT2、KelchKEAP1、KelchKLHL3、MDM2-SWIB、ODPH-VHL、SCF-SKP2、SCF-SKP2-CKS1、SCF-CULLIN、SCF-FBW7、SCF-FBX05、SCF-TRCP1、SCF-CUL4、E6-AP、SIAH、HECT结构域家族、环指家族、U框家族和其组合；
(b)所述同源sgRNA是可激活的sgRNA，其在所述可激活的sgRNA的非必需区域中带有失活序列，其中所述失活序列包含一个或多个核酸内切酶识别位点；或
(c)(a)和(b)的组合。


2.根据权利要求1所述的系统，其中所述Cas核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。


3.根据权利要求1所述的系统，其中所述可激活的sgRNA靶向核酸分子的转录链。


4.根据权利要求1所述的系统，其中所述失活序列是顺式作用核酶。


5.根据权利要求4所述的系统，其中所述顺式作用核酶由SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的核酸分子编码。


6.根据权利要求1所述的系统，其中所述可激活的sgRNA由SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21或SEQIDNO:22的核酸分子编码。


7.根据权利要求1所述的系统，其还包含可激活的sgRNA的阵列，其中所述同源sgRNA靶向所述可激活的sgRNA的阵列中的至少一个可激活的sgRNA。


8.一种融合蛋白，其包含与一个或多个降解决定子序列融合的Cas核酸内切酶，所述降解决定子序列选自：
(i)非规范的Cdc20或Chd1识别基序，或
(ii)由连接酶靶向的序列，所述连接酶选自EMI1、TRP1、CBL-PTK、CBL-MET、COP1、CRL4-CDT2、KelchKEAP1、KelchKLHL3、MDM2-SWIB、ODPH-VHL、SCF-SKP2、SCF-SKP2-CKS1、SCF-CULLIN、SCF-FBW7、SCF-FBX05、SCF-TRCP1、SCF-CUL4、E6-AP、SIAH、HECT结构域家族、环指家族、U框家族和其组合。


9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述Cas核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。


10.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述一个或多个降解决定子序列与所述Cas核酸内切酶融合，在它们之间设置有一个或多个接头。


11.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述一个或多个降解决定子序列在所述Cas核酸内切酶的N末端、C末端或N末端和C末端处与所述Cas核酸内切酶融合。


12.一种多核苷酸，其编码根据权利要求8所述的融合蛋白。


13.一种载体，其包含根据权利要求12所述的多核苷酸。


14.一种可激活的单向导RNA(sgRNA)，其在所述sgRNA的非必需区域中带有失活序列，其中所述失活序列包含一个或多个核酸内切酶识别位点。


15.根据权利要求14所述的可激活的sgRNA，其中所述可激活的sgRNA结合靶核酸分子的转录链。


16.根据权利要求14所述的可激活的sgRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：瑞安·E·克拉克，布拉德利·J·梅里尔，马修·S·麦克道格尔，汉娜·M·彭宁顿，布莱恩·R·谢赫，
申请(专利权)人：伊利诺伊大学理事会，
类型：发明
国别省市：美国;US