检测CAH相关真假基因的方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测CAH相关真假基因的方法。具体的，本发明专利技术公开了一种确定CAH相关基因的突变情况的检测方法，其中CAH相关基因包括：CYP21A2基因和CYP11B1基因，所述方法包括以下步骤：S1：提取样品中DNA并使用引物组进行PCR扩增；S2：用三代测序平台对扩增产物进行检测；S3：对测序结果进行分析得到CAH相关基因的突变情况。本发明专利技术公开的方法通过设计引物组将真假基因一起扩出，通过长片段建库测序可检测出突变类型。该方法可以同时检测到已知的CYP21A2和CYP11B1基因致病突变，且灵敏度高，只需样品中含有1-50ngDNA即可；操作方便；可以检测到长片段的缺失，区分真假基因，同时可检测到未知的染色体结构变异。染色体结构变异。

【技术实现步骤摘要】
检测CAH相关真假基因的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测CAH相关真假基因的方法。

技术介绍

[0002]人类基因组大约有2.91G个碱基，在两万多个基因中有一些特别的基因。这些基因有非常相似的假基因，给现有的检测方法带来了很大的困扰。由于真假基因的相似性，在人类细胞减数分裂时染色体联会期间可能出现错误的重组，产生真假基因的融合，因此产生新的突变导致真基因的表达功能丧失或不全。
[0003]先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是一种由于肾上腺皮质激素合成过程中酶的缺陷所引起的疾病，属常染色体隐性遗传病，引起男性化者又称肾上腺性征异常综合征。典型的CAH发病率约为1/10000，而非典型的发病率约为典型的10倍，并有种族特异性。21-羟化酶缺乏症(ZD-OHD)是先天性肾上腺皮质增生症中最常见的一种，占典型病例的90％-95％，CAH会导致低血钠及高血钾、严重者可导致休克，对于新生儿来讲未出现症状时做出尽早的诊断，可有效地减少肾上腺危症的发病率及病死率，这是至关重要的。
[0004]超过90％的CAH由CYP21A2基因突变导致，CYP21A2(Gene ID:1589)位于染色体6p21.3，全长3.5kb，在距其30kb处有一个高度同源的假基因CYP21A1P(Gene ID:1590)，外显子同源性达98％，内含子同源性达96％。假基因与CYP21A2的主要区别为外显子3中8bp的缺失，外显子7中1bp的插入，及外显子8发生的C到T的点突变形成终止密码子，这些变异导致假基因没有功能。该基因突变致使21-羟化酶部分或完全缺乏，由于皮质醇合成分泌不足，雄激素合成过多，致使临床出现轻重不等的症状。可表现为单纯男性化典型、失盐型和非典型三种类型。
[0005]CYP21A2与CYP21A1P排列位置相近且同源度很高，因此90％～95％的21羟化酶等位基因突变与真假基因在细胞减数分裂期间出现同源重组偏差或者连锁不平衡所致的真假基因错配有关；包括真基因大片段缺失和真假基因间碱基互相转换两种，其中c.293-13C>G和真假基因融合为最常见2种突变类型，分别占34.2％和18.4％(参考文献：《The next 150 years of congenital adrenal hyperplasia》)，CYP21A2的突变70％-80％来源于CYP21A2与CYP21A1P的碱基互换，因而真假基因辨别显得尤为重要。
[0006]11β-羟化酶缺陷症(11β-OHD)约占CAH的5％-8％，CYP11B1是11β-羟化酶的编码基因，CYP11B1存在假基因CYP11B2。此酶缺乏时，雄激素和11-脱氧皮质酮均增多，临床表现出与21-羟化酶缺乏相似的男性化症状，但程度较轻。
[0007]现有的基因测序主要包括以下几种：
[0008](一)一代测序，即设计很多对引物，通过普通PCR扩增，一代测序后再进行全长拼接。其具有以下缺陷：
[0009]1、读长短一般为500-800bp，遇到poly结构测序质量不好，不能准确判读；
[0010]2、需要设计7对左右引物，工作量大，操作繁琐；
[0011]3、低剂量基因组不能很好检测全长，需要一个样本很大量DNA才能拼接到全长；
[0012]4、一代测序读长较短，不能很好区分真假基因，假基因会影响真基因突变的判读；
[0013]5、不能区分真假基因转换的情况。
[0014](二)二代测序，即提取人的全基因组，打断建库后进行测序。其具有以下缺陷：
[0015]1、需要的数据量较大，低频突变需要深度很大才能检测到，成本高；
[0016]2、读长短，长片段的缺失或插入变异没办法检测到；
[0017]3、由于读长很短，没办法区别真假基因，就不能判断真基因与假基因序列相同的区域的突变是来自于真基因或是假基因。
[0018](三)针对CYP21A2/CYP21A1P、CYP11B1/CYP11B2设计很多对引物，引物在同一管进行扩增，多重PCR产物二代建库测序。其具有以下缺陷：
[0019]操作繁琐，不能辨别真假基因，不能发现真假基因转换的变异，不适合大规模检测。
[0020](四)MLPA检测，即多重连接探针扩增技术。其具有以下缺陷：
[0021]1、MLPA受到DNA样本纯净度影响较大，对基因组纯度要求很高，基因组中存在杂质会影响MLPA中探针杂交与连接反应；
[0022]2、已知MLPA试剂盒只针对目前高发缺失突变设计探针进行检测，很难发现未知突变；
[0023]3、MLPA实验每次需要检测正常人样本做为对照样本，若毛细管电泳检测时对照样本会出现异常情况，需要重新进行实验；
[0024]4、不能区分真假基因转换导致的重复与缺失与真实缺失重复之间的差别，从而无法仔细洞悉其致病机理与基因结构；
[0025]5、不能检测内含子区域；
[0026]6、对于点突变的检测不准确。
[0027](五)MLPA结合一代测序
[0028]为了检测出具体的突变位点，目前实验方法用的较多的是MLPA结合一代测序进行突变检测。其具有以下缺陷：
[0029]1、一代测序验证会引入假基因干扰，不能很好的区分真假基因，影响结果的准确性；
[0030]2、不能区分真假基因转换的情况。
[0031](六)巢式PCR
[0032]先根据真假基因的不同位点设计引物，以区别真假基因，然后在第一次PCR产物基础上进行巢式PCR扩增和检测。其具有以下缺陷：
[0033]1、这种方法只能检测有限的几种突变，如果发生未知突变则很难解释结果；
[0034]2、针对基因全长设计区分真假基因的引物有困难；
[0035]3、如果第一轮PCR产物为假基因，则检测结果不准确。
[0036]由于现有的测序技术的种种局限性，因此，亟需专利技术一种新的能够准确区分真假基因的测序技术。

技术实现思路

[0037]本专利技术的设计思路为：将真假基因同时扩增出来测序，通过新的三代测序技术的
长读长优势和生信分析方法，能同时检测基因的indel突变或融合突变，还有成本低和操作方便的优势。本专利技术以CAH的致病基因为例阐述这个检测方法。本专利技术公开的测序方法可以准确区分真假基因，同时能够检测到未知的染色体结构变异。
[0038]具体的，本专利技术的技术方案如下：
[0039]本专利技术第一个方面公开了一种引物组，所述引物组包括：第一引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；第二引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
[0040]术语“引物”意指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，除非特定限制，否则所述术语涵盖自然中生物的DNA复制和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物(通常为DNA引物)。之本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组，其特征在于，所述引物组包括：第一引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；第二引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。2.一种PCR扩增体系，其特征在于，所述PCR扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及位于所述PCR扩增体系中的权利要求1所述的引物组。3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。4.一种确定CAH相关基因的突变情况的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：提取样品中DNA并使用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增；S2：用三代测序平台对扩增产物进行检测；S3：对测序结果进行分析得到CAH相关基因的突变情况。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：高贵丽，郎娜，高玉梅，汪德鹏，
申请(专利权)人：北京希望组生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：