一种Actin内参基因高灵敏检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了定量PCR扩增人Actin基因的引物对、探针及包含所述引物对和探针的试剂盒。本发明专利技术的引物对、探针和包含所述引物对和/或探针的试剂盒在定量PCR检测Actin基因中的重复性好，灵敏度高，特异性好，能够区分基因组中的Actin基因和其假基因，而且对人源Actin基因具有检测的通用性，为检测其他功能性基因的相对定量或绝对定量提供可靠地基础。

【技术实现步骤摘要】
一种Actin内参基因高灵敏检测方法及试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，具体地，涉及一种Actin内参基因高灵敏检测方法及试剂盒。
技术介绍
荧光定量PCR(real-timePCR)因其对核酸分子定量准确、特异性高、灵敏度高和重复性好的特点，已成为定量分析基因表达水平最广泛使用的的技术之一。该技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。或者使用荧光染料SYBR，SYBR可以结合到双链DNA上面，当体系中的模板被扩增时，SYBR可以有效结合到新合成的双链上面，随着PCR的进行，结合的SYBR染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量的目的。荧光定量PCR分为绝对定量和相对定量两种分析方法。绝对定量是用标准曲线来检测未知样本的精确拷贝数；相对定量是检测未知样本间基因表达的差异。相对定量要求不同组织和细胞样本中起始模板数量、基因片段的完整性和提取效率、酶的有效性和PCR扩增效率、转录活性等参数都相同，分析结果才真实可靠。但实际上这些参数不可能完全相同，为了减少这种参数差异的影响，通常会选择看家基因作为内参基因与目的基因同时检测，对目的基因的检测结果进行校正和标准化，从而真实反映目的基因的表达量。因此选择合适的看家基因成为实验结果准确的关键。β-actin基因编码的β-肌动蛋白是细胞骨架的主要成分，在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。存在于所有真核细胞中，在真核细胞进化过程中高度保守，其mRNA表达数量高且稳定。β-actin被广泛用作相对定量分析中的内参基因，已经在人和多种动物中建立了检测β-actin的real-timePCR方法。假基因是哺乳动物基因在进化过程中形成的特有产物，由相应功能基因(fuctionalgene)转录本的cDNA拷贝插入细胞基因组后形成，没有编码多肽的功能，被称为“假基因”。在许多哺乳动物的不同基因家族中都发现存在相应的假基因，细胞色素C基因家族、小鼠的α-管状蛋白、人的β-actin、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等，其中β-actin至少存在20种以上的假基因。由于假基因与相应的具有编码功能的功能基因的转录本间具有高度同源性且片段大小相同，因而易被误认为是扩增到的目的基因的cDNA段，而造成real-timePCR法诊断时出现假阳性结果从而影响方法的可靠性。在基因组中除了actin基因外，还有一些假基因与actin的序列同一性较高。因此，目前亟需针对于人源Actin基因特异性检测的实时荧光定量PCR引物探针及检测方法。
技术实现思路
本专利技术PCR扩增actin与通常的定量PCR扩增cDNA用actin的cDNA作为内参不同，扩增的是基因组DNA的actin。本专利技术人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了检测基因组DNA中的Actin基因的引物对和探针。在此基础上，本专利技术人得到了荧光定量PCR测定Actin基因的检测方法和试剂盒。本专利技术的方法或试剂盒能够特异性检测人源内参Actin基因。由此提供了下述专利技术：本专利技术的一个方面涉及实时荧光定量PCR检测人源Actin基因的引物对，其选自如下的4个引物对中的任意一个、两个、三个或四个：引物对1，SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的引物对；引物对2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的引物对；引物对3，SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的引物对；和引物对4，SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的引物对；本专利技术的另一个方面涉及一种荧光定量PCR检测人源Actin基因的探针，其选自如下的3个探针中的一个、两个或者三个：探针A：其核酸序列如SEQINNO：9所示；探针B：其核酸序列如SEQINNO：10所示；和探针C：其核酸序列如SEQINNO：11所示；在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，优选地，所述荧光报告基团选自FAM、Hex、TET、VIC、ROX、TAMRA和Cy5中的任意一个，更优选地所述探针5’端标记荧光集团Hex；在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团；优选地，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和MGB；更优选地，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。FAM的结构式以及连接方式如下面的式I所示。BHQ1的结构式以及连接方式如下面的式II所示。Hex的结构式以及连接方式如下面的式III所示。TRAMA的结构式以及连接方式如下面的式IV所示。MGB的结构式以及连接方式如下面的式V所示。本专利技术的另一个方面涉及一种荧光定量PCR检测人源Actin基因的引物对和探针的组合；所述的引物对为选自前述引物对1、引物对2、引物对3和引物对4中的任意一个；所述的探针为选自前述探针A、探针B和探针C中的任意一个。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的引物对为前述引物对1，所述的探针为前述探针A。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的引物对为前述引物对2，所述的探针为前述探针A。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的引物对为前述引物对3，所述的探针为前述探针A。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的引物对为前述引物对4，所述的探针为前述探针C。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的引物对为前述引物对4，所述的探针为前述探针B。本专利技术提供的用于人源Actin基因荧光定量PCR检测的引物对和探针组合，特异性强，重复性好，灵敏度高；且对含有人源Actin基因的样本检测具有通用性。本专利技术的另一方面还提供了人源Actin基因的荧光定量PCR的检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测样本的DNA；(2)制备Actin基因标准品，制作标准曲线；(3)以前述的引物对1、引物对2、引物对3和引物对4中的任一引物对作为引物并以探针A、探针B和探针C中的任一探针作为探针进行组合，对待检测样本和标准品进行实时荧光定量PCR检测；(4)进一步地，所述样品的荧光定量PCR检测结果与Actin标准品的拷贝数与Ct值的标准曲线进行对比得知；优选地，步骤(1)所述的待测样品为人外周血样本；进一步的，步骤(2)所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物对，其包含如下的4个引物对中的任意一个、两个、三个活或四个：/n引物对1，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对/n引物对2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对/n引物对3，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对；和/n引物对4，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物对。/n

【技术特征摘要】
1.引物对，其包含如下的4个引物对中的任意一个、两个、三个活或四个：
引物对1，SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物对
引物对2，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物对
引物对3，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物对；和
引物对4，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的引物对。


2.探针，其包含如下的2个探针中的任意一个、两个或三个：
探针A，其核酸序列如SEQIDNO:9所示
探针B，其核酸序列如SEQIDNO:10所示；和
探针C，其核酸序列如SEQIDNO:11所示。


3.根据权利要求2所述的探针，其中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
优选地，所述荧光报告基团选自FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5；
更优选地，所述荧光报告基团选自Hex；
优选地，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2、BHQ3和MGB；
更优选地，所述荧光淬灭基团选自MGB。


4.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的引物对，和/或权利要求2至3中任一权利要求所述的探针。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其包含：
引物对1和探针A；
和/或
引物对2和探针A；
和/或
引物对3和探针A；
和/或
引物对4和探针C；
优选地，所述试剂盒还包含PCR反应所需的试剂，例如Mg2+、反应缓冲液、dNTP和Taq酶。


6.一种特异性检测人源a...

【专利技术属性】
技术研发人员：金华君，郝方元，张喜艳，经荧萍，刘相岑，钱其军，
申请(专利权)人：上海细胞治疗集团有限公司，上海细胞治疗研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31