一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，采用抗原血管内皮生长因子(VEGF)亲和富集生物样品中的贝伐珠单抗，酶解获得特征性肽段，通过定量特征性肽段从而定量生物样品中贝伐珠单抗的含量，具有特异性高、高通量和灵敏度高的优点。

A mass spectrometry method for bioanalysis of bevacizumab based on immunoaffinity

【技术实现步骤摘要】
一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法。
技术介绍
单克隆抗体药物具有特异性高、靶向性强、半衰期长和毒副作用低等特点，是全球生物制药市场与研发中最重要的品类之一，已成功应用于癌症、自身免疫疾病等多种疾病的临床治疗。贝伐珠单抗是一种靶向血管内皮生长因子(VEGF)的重组人源化单克隆抗体，应用于癌症的临床治疗，是全球畅销前十的药物之一。建立规范可靠的生物分析方法对单克隆抗体药物及其生物类似药的药代动力学研究具有重要的意义。目前，蛋白类药物生物样品分析方法包括酶联免疫吸附方法(ELISA)和质谱法，其中ELISA是主要采用的分析方法。ELISA法具有灵敏度高、通量大等优点，但特异性低、易受内源性物质干扰，影响定量的可靠性；而质谱法特异性高，但灵敏度低，故而需要一种新的贝伐珠单抗生物分析。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，采用抗原血管内皮生长因子(VEGF)亲和富集生物样品中的贝伐珠单抗，酶解获得特征性肽段，通过定量特征性肽段从而定量生物样品中贝伐珠单抗的含量，具有特异性高、高通量和灵敏度高的优点。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，包括如下步骤：步骤S1，采用空白基质配制系列浓度梯度的贝伐珠单抗标准品溶液；步骤S2，采用空白基质配制靶向血管内皮生长因子(VEGF)的康柏西普蛋白溶液，作为内标工作溶液；步骤S3，分别取相同体积的空白基质、系列浓度中的各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品，贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品分别加入内标工作溶液，空白基质加入与内标工作液体积相同的空白基质；再分别向空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入生物素化的血管内皮生长因子(VEGF)和磷酸缓冲盐溶液(PBS)，摇晃孵育；步骤S4，向孵育后的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入带有亲和素的磁珠，室温孵育富集；步骤S5，向步骤S4中获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入胰蛋白酶进行酶解；步骤S6，采用固相萃取板(SPE板)纯化步骤S5获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品；步骤S7，将步骤S6中获得的各样品进行色谱-质谱分析，并对质谱数据进行分析，定量分析贝伐珠单抗。根据以上方案，所述的步骤S1中的系列浓度梯度的范围是0.15μg/mL-15μg/mL。根据以上方案，所述的步骤S2中的内标工作溶液的浓度为10μg/mL。根据以上方案，所述的步骤S3中的摇晃孵育是25℃，800rpm摇晃孵育1h。根据以上方案，所述的步骤S4中的室温孵育时间为30min，孵育完成后使用含有0.1％的牛血清蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗孵育完的磁珠，并去掉清洗液。根据以上方案，所述的步骤S5中的酶解具体过程是，分别加入1％的RapiGestSF溶液、100mM的二硫苏糖醇(DTT)和50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(Tris-HCl)，95℃反应5min；再加入200mM碘乙酰胺(IAA)，避光反应30min，12000rpm4℃离心5min并取上清夜，加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件是37℃酶解16h，加入0.5％的甲酸终止酶解反应。根据以上方案，所述的步骤S6的纯化具体是，分别用甲醇和超纯水活化平和固相萃取板(SPE板)，将酶解后的各样品上样，再分别用2％FA水溶液和5％甲醇淋洗，最后用含2％氨水和40％乙腈的水溶液洗脱样品。根据以上方案，所述的步骤S7的质谱分析中设置贝伐珠单抗的特征性肽段为FTFSLDTSK；康柏西普蛋白的特征性肽段为ELVIPCR。本专利技术的有益效果是：1)显著提高质谱法的灵敏度，本方法定量下限是150ng/mL；2)抗原富集显著降低了生物样品中的内源性物质，质谱法检测时间是8min，大大提高了检测的通量；3)选择抗原进行免疫亲和，选择的特征性肽段在种属大鼠、猴和人中具有特异性，可用于临床前大鼠、猴血清/血浆样品和临床样品的生物分析。附图说明图1是实施例中定量下限样品中贝伐珠单抗特征性肽段FTFSLDTSK色谱图谱；图2是实施例中贝伐珠单抗的校准曲线；图3是实施例中大鼠血浆专属性考察色谱图(A)贝伐珠单抗(B)内标。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术的技术方案进行说明。一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，检测大鼠血液中含有的贝伐珠单抗，包括如下步骤：步骤S1，采用大鼠空白血浆配制系列浓度梯度的贝伐珠单抗标准品溶液，包括0.15,0.30,0.75,1.50,4.50,7.50,13.5和15.0μg/mL的浓度的标准品溶液；步骤S2，采用大鼠空白血浆配制靶向血管内皮生长因子(VEGF)的康柏西普蛋白溶液，浓度为10μg/mL，作为内标工作溶液；步骤S3，分别取50μL的空白基质、系列浓度中的各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品，置于低吸附离心管中，贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品分别加入5μL的内标工作溶液，空白基质加入5μL的空白基质；再分别向空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入5μL的生物素化的血管内皮生长因子(VEGF)和140μL的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，25℃800rpm孵育1h；步骤S4，向孵育后的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入26μL(10mg/mL)带有亲和素的磁珠，室温孵育30min，孵育完成后配合磁力架使用含有0.1％的牛血清蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗孵育完的磁珠三次，并去掉清洗液；步骤S5，向步骤S4中获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中分别加入4μL的1％的RapiGestSF溶液、4μL的100mM的二硫苏糖醇(DTT)和32μL的50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(Tris-HCl)，95℃反应5min；再加入4μL的200mM碘乙酰胺(IAA)，避光反应30min，补加50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(Tris-HCl)至总体积为60μL，12000rpm4℃离心5min并取上清夜置于新的离心管中，加入2μL(50ng/μL)的胰蛋白酶进行酶解，酶解条件是37℃酶解16h，加入0.5％的甲酸终止酶解反应；步骤S6，分别用200μL甲醇和超纯水活化平和固相萃取板(SPE板)，将酶解后的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品上样，再分别用2％FA水溶液和5％甲醇淋洗，每个固相萃取板淋洗两遍，最后用含2％氨水和40％乙腈的水溶液洗脱样品；步骤S7，将步骤S6中获得的各样品进行色谱-质谱分析，并对质谱数据进行分析，定量分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤S1，采用空白基质配制系列浓度梯度的贝伐珠单抗标准品溶液；/n步骤S2，采用空白基质配制靶向血管内皮生长因子的康柏西普蛋白溶液，作为内标工作溶液；/n步骤S3，分别取相同体积的空白基质、系列浓度中的各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品，贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品分别加入内标工作溶液，空白基质加入与内标工作液体积相同的空白基质；再分别向空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入生物素化的血管内皮生长因子和磷酸缓冲盐溶液，摇晃孵育；/n步骤S4，向孵育后的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入带有亲和素的磁珠，室温孵育富集；/n步骤S5，向步骤S4中获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入胰蛋白酶进行酶解；/n步骤S6，采用固相萃取板纯化步骤S5获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品；/n步骤S7，将步骤S6中获得的各样品进行色谱-质谱分析，并对质谱数据进行分析，定量分析贝伐珠单抗。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，采用空白基质配制系列浓度梯度的贝伐珠单抗标准品溶液；
步骤S2，采用空白基质配制靶向血管内皮生长因子的康柏西普蛋白溶液，作为内标工作溶液；
步骤S3，分别取相同体积的空白基质、系列浓度中的各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品，贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品分别加入内标工作溶液，空白基质加入与内标工作液体积相同的空白基质；再分别向空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入生物素化的血管内皮生长因子和磷酸缓冲盐溶液，摇晃孵育；
步骤S4，向孵育后的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入带有亲和素的磁珠，室温孵育富集；
步骤S5，向步骤S4中获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品中加入胰蛋白酶进行酶解；
步骤S6，采用固相萃取板纯化步骤S5获得的空白基质、各浓度的贝伐珠单抗标准品溶液和待检测样品；
步骤S7，将步骤S6中获得的各样品进行色谱-质谱分析，并对质谱数据进行分析，定量分析贝伐珠单抗。


2.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S1中的系列浓度梯度的范围是0.15μg/mL-15μg/mL。


3.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的贝伐珠单抗生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S2中的内标工作溶液的浓度为10μg/mL。

【专利技术属性】
技术研发人员：陆剑虹，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31