一种检测红葡萄酒中类黄酮物质的方法技术

一种检测红葡萄酒中类黄酮物质的方法，涉及生物技术检测领域，采用外标定量法结合液相色谱‑质谱联用技术手段，对液相色谱‑质谱的条件参数进行优化，准确且能够同时检测干红葡萄酒内25种黄酮类化合物，具有高精度、前处理简单、灵敏度高、重复性好等优点。

A method for determination of flavonoids in red wine

【技术实现步骤摘要】
一种检测红葡萄酒中类黄酮物质的方法
本专利技术涉及生物技术检测领域，具体涉及一种检测红葡萄酒中类黄酮物质的方法。
技术介绍
黄酮化合物是具有相同的基本C骨架，大部分与糖类物质结合为苷的一类化合物，它们在自然界广泛存在，主要分布于蔬菜、水果和药用植物中，可分为总黄酮、异黄酮、黄酮醇(及其苷类)和花青素。黄酮化合物是普遍存在于许多植物中的次生代谢产物，它不仅在植物的生理学中发挥众多功能，而且也是人类营养与健康的重要化合物。黄酮类化合物具有众多的药理学活性，例如抗菌、抗病毒功效、抗肿瘤、抗氧化自由基、抗心脑血管疾病等等。研究表明，葡萄酒中富含黄酮类化合物，然而这些成分在不同品种的葡萄酒及不同年份的葡萄酒中的含量是否有差异，还尚不清楚。因此，发展一种快速、准确、灵敏的方法对葡萄红酒中的功效成分进行测定，对正确评价其保健作用及品质、科学饮酒具有重要的意义。目前国内外关于葡萄红酒种黄酮类物质的分离、鉴定及检测取得了一定的进展，但是仍然滞后于研究需求及生产实践，缺乏对于葡萄红酒中主要黄酮类化合物进行全面检测分析的方法体系。现有技术中，针对黄酮类化合物检测最常用的方法是比色法，比色法用时少，成本低，但由于红酒中成分十分复杂，会有其他物质对比色结果造成干扰，准确度不高。因此，目前基础研究及生产实践都亟需建立葡萄糖红酒中黄酮类化合物的检测分析方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测红葡萄酒中类黄酮物质的方法，采用外标定量法结合液相色谱-质谱联用技术手段，对液相色谱-质谱的条件参数进行优化，准确且能够同时检测干红葡萄酒内25种黄酮类化合物，具有高精度、前处理简单、灵敏度高、重复性好等优点。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测红葡萄酒中类黄酮物质的方法，包括如下步骤：步骤S1构建标准曲线，称取黄酮类化合物标准品，使用70％的甲醇水溶液溶解，再使用70％的乙腈水溶液按浓度范围稀释出系列梯度浓度的标准品混合液，再将各浓度分别进行步骤S3和步骤S4，构建标准曲线；步骤S2样品制备，取待检测样品，加入9倍体积的70％甲醇水溶液，涡旋混合均匀，离心取上清液进行步骤S3和步骤S4；步骤S3液相质谱分析，液相色谱条件是4℃进样，柱温40℃，流速为400μL/min；液相梯度如下：0-3min，B液从5％线性变化到20％；3-4.3min，B液维持在20％；4.3-9min，B液从20％线性变化到45％；9-11min，B液从45％线性变化到98％；11-13min，B液维持在98％；13-13.1min，B液从98％线性变化到5％；13.1-15min，B液维持在5％；步骤S4质谱分析，质谱分析条件是：采用ESI源，正负离子同时扫描模式；正离子模式：离子源温度(sourcetemperature)：550℃；雾化气压(ionSourceGas1(Gas1))：55；辅助气压(IonSourceGas2(Gas2))：50；气帘气(Curtaingas(CUR))：30；喷雾电压(ionSaparyVoltageFloating(ISVF)):5500V；负离子模式：离子源温度(sourcetemperature)：550℃；雾化气压(ionSourceGas1(Gas1))：55；辅助气压(IonSourceGas2(Gas2))：50；气帘气(Curtaingas(CUR))：30；喷雾电压(ionSaparyVoltageFloating(ISVF)):-4500V。根据以上方案，所述的步骤S1中的系列梯度浓度范围是1-500000pg/mL。根据以上方案，所述的步骤S1中的黄酮类化合物标准品包括鹰嘴豆芽素A(BiochaninA)、对香豆酸(p-Coumaricacid)、柚皮素(Naringenin)、木犀草素(Luteolin)、儿茶素(Catechin)、山柰酚(Kaempferol)、二氢槲皮素(Taxifolin)、表儿茶素(Epicatechin)、杨梅素(Myricetin)、二氢山柰酚(Dihydrokaempferol)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin)、樱黄素(Prunetin)、槲皮苷(Quercitrin)、牡荆素(Vitexin)、山奈素(Kaempferide)、异懈皮苷(Quercetin3-glucoside)、阿魏酸(Ferulicacid)、圣草酚(Eriodictyol)、樱花素(Sakuranetin)、槲皮素(Quercetin)、芹黄素(Apigenin)、白杨素(Chrysin)、没食子酰儿茶素(Gallocatechin)、异鼠李素(Isorhamnetin)和木樨草素(Luteolin-7-O-glucoside)。根据以上方案，所述的步骤S2中的离心是4℃下14000g离心15min。根据以上方案，所述的步骤S3中的A液为0.1％甲酸水溶液；B液为0.1％乙腈溶液。根据以上方案，所述的步骤S4中的质谱分析的代谢物定量离子对、定性离子对，及其相应的碰撞能信息如下：其中，带有“_q”标记的为定量离子对，采用多反应监测模式检测，选择特异性好的离子对作为定量离子对，并辅以定性离子对，表中的DP是去簇电压(Declusteringpotential)、CE是碰撞能量(Collisionenergy)、CXP是碰撞室出口电压(Collisioncellexitpotential)。本专利技术的有益效果是：1)采用外标定量法，分析测量前的标准曲线构建流程简单，且构建的标准曲线能重复使用，简化后续的检测流程；2)采用液相色谱-质谱联用技术手段，优化的条件参数，准确且能够同时检测干红葡萄酒内25种黄酮类化合物，具有高精度、样品前处理简单、灵敏度高和重复性好的优点。附图说明图1是实施例中的红葡萄酒样品的TIC图谱。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术的技术方案进行说明。一种检测红葡萄酒中类黄酮物质的方法，包括如下步骤：步骤S1构建标准曲线，称取黄酮类化合物标准品，使用70％的甲醇水溶液溶解配制成20μg/mL的标准品混合母液，再使用70％的乙腈水溶液将标准品混合母液分梯度稀释出系列梯度浓度的标准品混合液，系列梯度浓度包括1pg/mL、2.5pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2500pg/mL、5000pg/mL、10000pg/mL、25000pg/mL、50000pg/mL、100000pg/mL、250000pg/mL和500000pg/mL，再将各浓度分别进行步骤S3和步骤S4，构建标准曲线；所述的黄酮类化合物标准品包括鹰嘴豆芽素A、对香豆酸、柚皮素、木犀草素、儿茶素、山柰酚、二氢槲皮素、表儿茶素、杨梅素、二氢山柰酚、表没食子儿茶素、樱黄素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测红葡萄酒中类黄酮物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤S1构建标准曲线，称取黄酮类化合物标准品，使用70％的甲醇水溶液溶解，再使用70％的乙腈水溶液按浓度范围稀释出系列梯度浓度的标准品混合液，再将各浓度分别进行步骤S3和步骤S4，构建标准曲线；/n步骤S2样品制备，取待检测样品，加入9倍体积的70％甲醇水溶液，涡旋混合均匀，离心取上清液进行步骤S3和步骤S4；/n步骤S3液相质谱分析，液相色谱条件是4℃进样，柱温40℃，流速为400μL/min；液相梯度如下：0-3min，B液从5％线性变化到20％；3-4.3min，B液维持在20％；4.3-9min，B液从20％线性变化到45％；9-11min，B液从45％线性变化到98％；11-13min，B液维持在98％；13-13.1min，B液从98％线性变化到5％；13.1-15min，B液维持在5％；/n步骤S4质谱分析，质谱分析条件是：采用ESI源，正负离子同时扫描模式；/n正离子模式：离子源温度：550℃；雾化气压：55；辅助气压：50；气帘气：30；喷雾电压:5500V；/n负离子模式：离子源温度：550℃；雾化气压：55；辅助气压：50；气帘气：30；喷雾电压:-4500V。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测红葡萄酒中类黄酮物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1构建标准曲线，称取黄酮类化合物标准品，使用70％的甲醇水溶液溶解，再使用70％的乙腈水溶液按浓度范围稀释出系列梯度浓度的标准品混合液，再将各浓度分别进行步骤S3和步骤S4，构建标准曲线；
步骤S2样品制备，取待检测样品，加入9倍体积的70％甲醇水溶液，涡旋混合均匀，离心取上清液进行步骤S3和步骤S4；
步骤S3液相质谱分析，液相色谱条件是4℃进样，柱温40℃，流速为400μL/min；液相梯度如下：0-3min，B液从5％线性变化到20％；3-4.3min，B液维持在20％；4.3-9min，B液从20％线性变化到45％；9-11min，B液从45％线性变化到98％；11-13min，B液维持在98％；13-13.1min，B液从98％线性变化到5％；13.1-15min，B液维持在5％；
步骤S4质谱分析，质谱分析条件是：采用ESI源，正负离子同时扫描模式；
正离子模式：离子源温度：550℃；雾化气压：55；辅助气压：50；气帘气：30；喷雾电压:5500V；
负离子模式：离子源温度：550℃；雾化气压：55；辅助气压：50；气帘气：30；喷雾电压:-4500V。


2.根据权利要求1所述的检测红葡萄酒...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠萍，刘泰驿，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31