一种基于免疫纯化结合质谱检测的25-羟维生素D分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于免疫纯化结合质谱检测的25‑羟维生素D分析方法，主要步骤为：制备生物素标记抗体、制备生物素标记抗体包被的磁珠、富集纯化样品和质谱检测。该分析方法利用抗体亲和的高特异性，可以将25‑(OH)D特异地从复杂生物样本中富集并纯化，同时实现25‑(OH)D2和25‑(OH)D3的分别精准检测；抗体偶联磁珠富集法结合质谱检测在实现高通量、灵敏和准确定量的同时，极大地提升了液相质谱系统的使用效率。

An analytical method for 25 hydroxyvitamin D Based on immunopurification and mass spectrometry

【技术实现步骤摘要】
一种基于免疫纯化结合质谱检测的25-羟维生素D分析方法
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种基于免疫纯化结合质谱检测的25-羟维生素D分析方法。
技术介绍
25-羟维生素D(25-(OH)D)包括25-羟维生素D2(25-(OH)D2)和25-羟维生素D3(25-(OH)D3)，是维生素D在体内的主要存在形式。血清25-(OH)D的高低可以反映人体维生素D的储存水平，并且与维生素D缺乏的临床症状是相关的。生物样本(如全血、血清、尿液或唾液)中的25-(OH)D2和25-(OH)D3检测方法主要包括液相色谱质谱法和免疫分析法。液相色谱质谱法检测前，25-(OH)D2和25-(OH)D3需从生物样本中富集和分离出来，传统的样本处理方法主要包括沉淀法，液液萃取法和固相萃取法，获得样本中的物质根据性质不同经液相色谱分离随后根据质核比不同经质谱检测分析。液相色谱质谱法可实现25-(OH)D2和25-(OH)D3的同时检测。但是，液相色谱质谱法的样本的前处理均为非特异性富集方法，富集的样本成分较为复杂，富集出的样本中除含有25-(O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于免疫纯化结合质谱检测的25-羟维生素D分析方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一，制备生物素标记抗体：/n(1)用pH为8.1的磷酸盐缓冲液透析25-羟维生素D抗体16-24h，将透析后的抗体加入生物素，然后进一步加入磷酸盐缓冲液对抗体进行稀释，并混匀得到混合液；/n(2)将混合液置于恒温培养箱中，静置反应120±10min得到生物素标记抗体；/n(3)使用pH为7.4的磷酸盐缓冲液透析所述生物素化抗体16-24h；/n步骤二，制备生物素标记抗体包被的磁珠：/n(1)将亲和素磁珠用磁珠清洗液清洗，然后再用结合缓冲液复溶；/n(2)将溶解后的所述亲和素磁珠和步骤一制备的所述生物素...

【技术特征摘要】
1.一种基于免疫纯化结合质谱检测的25-羟维生素D分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，制备生物素标记抗体：
(1)用pH为8.1的磷酸盐缓冲液透析25-羟维生素D抗体16-24h，将透析后的抗体加入生物素，然后进一步加入磷酸盐缓冲液对抗体进行稀释，并混匀得到混合液；
(2)将混合液置于恒温培养箱中，静置反应120±10min得到生物素标记抗体；
(3)使用pH为7.4的磷酸盐缓冲液透析所述生物素化抗体16-24h；
步骤二，制备生物素标记抗体包被的磁珠：
(1)将亲和素磁珠用磁珠清洗液清洗，然后再用结合缓冲液复溶；
(2)将溶解后的所述亲和素磁珠和步骤一制备的所述生物素标记抗体混合，然后置于恒温振荡箱振荡反应得到生物素标记抗体包被的磁珠；
(3)反应后，用磁珠清洗液清洗所述磁珠，并稀释，2-8℃保存待用；
步骤三，富集纯化样品：将样品加入同位素内标溶液、所述生物素标记抗体包被的磁珠，室温搅拌孵育，用超纯水重复洗涤至少3次；洗涤后的磁珠采用有机溶剂进行2次洗脱，并收集洗脱液；
步骤四，质谱检测：步骤三得到的所述洗脱液吹干后复溶或直接转移至微孔板中，上液相质谱仪器检测。


2.根据权利要求1所述的25-羟维生素D分析方法，其特征在于，步骤一中所述透析是在4℃或室温条件下进行的，持续16-24h。


3.根据权利要求1所述的25-羟维生素D分析方法，其特征在于，所述步骤一中的所述恒温箱温度设置为25±1℃。


4.根据权利要求1所述的25-羟维生素D分析方法，其特征在于，所述步骤一中所述抗体和生物素的重量比为10-20：1。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜宽，祝长城，许海峰，
申请(专利权)人：苏州新波生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32