一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法技术

本发明专利技术提供了一种超高效液相色谱‑串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法，属于分析化学技术领域。样品经甲酸/乙腈（10:90）提取，加入QuEChERS盐包振摇离心，提取液过OASIS PRIME HLB小柱和Dspe净化管处理，以Waters HSS T

Determination of 16 mycotoxins in tea by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

【技术实现步骤摘要】
一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法
本专利技术涉及分析化学
，尤其涉及一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法。
技术介绍
真菌毒素(mycotoxins)是某些真菌在一定环境条件下产生的，危害人和动物的次级毒性代谢产物。迄今发现超过400种真菌毒素，主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、单端孢霉烯族毒素中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、杂色曲霉素、桔青霉素等。这些毒素经口或皮肤吸入对人和动物具有急性毒性，还可作用于肝脏、肾脏、神经系统、内分泌系统和免疫系统，具有致畸、致癌、致突变、中毒性肾损害、肝细胞毒性、免疫抑制和生殖紊乱等慢性毒性。中国是茶叶的生产、出口和消费大国，关于茶叶尤其普洱茶、茯砖茶等发酵茶中真菌毒素污染已引起消费者的关注。虽然茶叶加工过程干燥环节可能杀灭茶中的大多数微生物，但若包装、贮藏不当，尤其茶叶吸湿受潮之后，可能受到真菌和真菌毒素污染。已有报道检出茶叶污染黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素、赭曲霉毒素、T-2毒素等真菌毒素。陈年老茶亦称年份茶，是指存储一段时间后具有保健功能的茶叶，由于其需要存储过程较长，存储不当将有可能导致茶叶发霉变质，产生毒素。目前国内外对一些茶叶中有关的黄曲霉菌B1、赭曲霉菌A等单一真菌毒素污染情况的检测分析较多，但是缺乏对茶叶中10种或10以上真菌毒素同时检测的研究。因此有必要建立一种同时检测茶叶中多种真菌毒素的方法。目前，茶叶中真菌毒素的检测方法主要包括薄层色谱法、酶联免疫法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法等。其中，酶联免疫法容易出现假阳性，只能作为筛查方法；高效液相色谱法需要柱前或柱后衍生，柱前衍生形成的副产物可能对色谱分离造成较大困难，在衍生化过程中，容易引入杂质或干扰峰，或使样品损失，柱后衍生对于一定的溶剂和有限的反应时间来说，所供选择的反应条件有限，容易造成反应不充分，或者反应副产物过多，而且柱后衍生需要额外的设备，反应器可造成峰展宽，降低分辨率，最终不但会影响定量结果，而且会对仪器带来污染；液相色谱-串联质谱联用技术与其它方法相比，定量更加准确，选择性和灵敏度也更高，已逐渐取代传统的液相色谱方法应用于茶叶中真菌毒素的检测。目前采用液相色谱-串联质谱联用技术检测茶叶毒素的前处理步骤比较复杂，需要使用到多功能进化柱、免疫亲和柱进行对提取液进行净化。国标中涉及的样品类型基质比较简单，通过两次净化基本能去除杂质。但对于基质复杂的茶叶而言，简单的两次净化，是很难去除杂质，而杂质过多将导致质谱分析时基质效应明显，最终定量不准确。因此必须采用更高效的方法对样品提取液进行净化。不同真菌毒素对溶剂要求不一，例如黄曲霉毒素不溶于水，一些含羧基基团毒素如伏马毒素、赭曲霉毒素等含有羧基集团毒素需要偏酸环境下进行提取。同时，有些提取溶剂更容易将茶叶中一些酸、醇、酚类等杂质提取到提取液中，而有些溶剂提取则提取液中杂质较少，因此选择最佳的提取溶剂对后续净化、检测以及样品回收率等均有很大的影响。采用液相色谱-串联质谱联用技术检测毒素过程中，流动相的选择影响到检测物的峰型、检测所需的时间等，因此，建立一种较好的流动相和梯度洗脱程序，可提高检测的灵敏度和减少检测时间，从而提高检测效率。目前国内外对茶叶中多种真菌毒素的检测方法不稳定，灵敏度低，只能同时检测一种或几种毒素，检测效率低，未见同时检测10种以上真菌毒素，且不能同时检测不同品种茶即不同程度发酵茶中的多种真菌毒素。本专利技术即针对上述的高效提取溶剂、净化环节和高效的流动相洗脱梯度程序等3个问题而研究提出。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法，本专利技术提供的前处理简单，测定方法稳定、准确、灵敏、快速，能够满足各类型茶叶中多毒素分析的需求。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法，其特征在于，包括制备供试样品和高效液相色谱-串联质谱法测定；其中，制备供试样品所用提取液为水按体积比3:1～1:3与体积比为1:5～1:10的甲酸/乙腈，后加入QuEChERS提取盐包；制备供试样品提取液采用dSPE净化管和OasisPRIMEHLB小柱进行净化；高效液相色谱-串联质谱法中色谱条件中流动项A为5～10mmol·L-1乙酸铵水溶液+体积比0.1％～1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；质谱条件中，质谱分析的离子源除玉米赤霉烯酮及内标是电喷雾负离子源ESI-，其余毒素均为电喷雾正离子源ESI+，检测方式：多反应离子监测MRM模式，毛细管电压：1.5kV；锥孔气流：氮气，流速50L·h-1；离子源温度：120℃；脱溶剂气溶剂气温度：500℃，流量为1000L/hr；碰撞气：高纯氩气；所检测的16种真菌毒素为：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、玉米赤霉烯酮、桔青毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯酮、雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、T-2毒素、HT-2毒素、杂色曲霉毒素、伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3。进一步的，制备供试样品包括如下步骤：样品处理：取粉碎的待测茶叶0.5g，茶叶样品加入10ml水和10ml体积比1:5～1:10的甲酸/乙腈溶液按混合后，置于自动振荡器中振摇10min；加入QuEChERS提取盐包，振摇1min，4000r/min离心5min，后取出上清液进行净化；净化：安装HLB小柱，不执行小柱活化步骤，取约0.4mL上清液通过HLB小柱，弃去滤液，然后再取1mL上清液，再次通过小柱并收集滤液。将滤液移到含有混合吸附剂的dSPE净化管中，在10000r/min下离心10min，上清液过0.22μm滤膜；吸取190μL于300μL内插管中，加入10μL稳定同位素混合溶液，涡旋混匀，待进样。进一步的，所述样品处理中，粉碎的待测茶叶过60目筛得到。进一步的，所述高效液相色谱-串联质谱法测定中，制备16种真菌毒素标准储备液并采用同位素13C17--AflatoxinB1(0.5μg/mL)，D6-Zearalenone(100μg/mL)，13C15-Deoxynivalenol(25μg/mL)，13C34--FumonisinB1(25μg/mL)，13C24--T-2Toxin(30μg/mL)，D5-OchratoxinA(50μg/mL)内标标准溶液；分别移取一定体积的6种同位素内标标准溶液于10mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，充分混匀后于-20℃避光保存，备用；样品测定：将净化后的样品进行超高效液相色谱-串联质谱法测定，其中：色谱条件为：WatersACQUITYHSST3柱，柱温：40℃；样品温度：15℃，进样体积：2μL，分析时间：8min流速：0.4mL·min-1，流动项A：5mmol·L-1乙酸铵水溶液+0.1％甲酸水溶液，流动相B：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法，其特征在于，包括制备供试样品和高效液相色谱-串联质谱法测定；/n其中，制备供试样品所用提取液为水按体积比3:1~1:3与体积比为1:5~1:10的甲酸/乙腈，后加入QuEChERS提取盐包；/n制备供试样品提取液采用dSPE净化管和Oasis PRIME HLB小柱进行净化；/n高效液相色谱-串联质谱法中色谱条件中流动项A为5 ~10mmol·L

【技术特征摘要】
1.一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法，其特征在于，包括制备供试样品和高效液相色谱-串联质谱法测定；
其中，制备供试样品所用提取液为水按体积比3:1~1:3与体积比为1:5~1:10的甲酸/乙腈，后加入QuEChERS提取盐包；
制备供试样品提取液采用dSPE净化管和OasisPRIMEHLB小柱进行净化；
高效液相色谱-串联质谱法中色谱条件中流动项A为5~10mmol·L-1乙酸铵水溶液+体积比0.1%~1%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；质谱条件中，质谱分析的离子源除玉米赤霉烯酮及内标是电喷雾负离子源ESI-，其余毒素均为电喷雾正离子源ESI+，检测方式：多反应离子监测MRM模式，毛细管电压：1.5kV；锥孔气流：氮气，流速50L·h-1；离子源温度：120℃；脱溶剂气溶剂气温度：500℃，流量为1000L/hr；碰撞气：高纯氩气；
所检测的16种真菌毒素为：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、玉米赤霉烯酮、桔青毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯酮、雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、T-2毒素、HT-2毒素、杂色曲霉毒素、伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3。


2.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法，其特征在于：制备供试样品包括如下步骤：
样品处理：取粉碎的待测茶叶0.5g，茶叶样品加入10ml水和10ml体积比1:5~1:10的甲酸/乙腈溶液按混合后，置于自动振荡器中振摇10min；加入QuEChERS提取盐包，振摇1min，4000r/min离心5min，后取出上清液进行净化；
净化：安装HLB小柱，不执行小柱活化步骤，取约0.4mL上清液通过HLB小柱，弃去滤液，然后再取1mL上清液，再次通过小柱并收集滤液，将滤液移到含有混合吸附剂的dSPE净化管中，在10000r/min\下离心10min，上清液过0.22μm滤膜；吸取190μL于300μL内插管中，加入10μL稳定同位素混合溶液，涡旋混匀，待进样。


3.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中16种真菌毒素的方法，其特征在于：所述高效液相色谱-串联质谱法测定中，制备16种真菌毒素标准储备液并采用同位素0.5μg·mL-1的13C17--AflatoxinB1，100μg·mL-1的D6-Zearalenone，25μg·mL-1的13C15-D...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文静，傅建炜，黄彪，韦航，
申请(专利权)人：福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35