天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法及其应用，采用顶空气相色谱法测定天然产物与厌氧菌菌液无氧环境共存培养过程中产生的代谢酸与弱碱中和反应生成的CO

【技术实现步骤摘要】
天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法及其应用
本专利技术属于分析化学及药理学
，具体涉及天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法及其应用。
技术介绍
近年来，随着抗菌药物的不合理使用，细菌耐药已经成为全球医学焦点，多种耐药细菌的出现使现所使用的抗生素药效大大降低，院内感染和临床药物的选择日趋困难。厌氧菌是人体内的主要正常菌群，因此，在临床各科感染中所占的比率越来越大，从而内源性厌氧菌感染也越来越受到人们的重视。对候选药物的厌氧菌抑菌活性测定是抗菌药物活性筛选以及新药发现的关键环节。天然产物的提取物具有药材来源广泛，价格低廉以及耐药性少等优势。因此，基于天然产物的药物开发对现代预防和控制细菌感染疾病，以及解决耐药性菌株的产生和抗生素短缺的问题具有重要意义。而天然产物提取物以及先导化合物日常性抗菌活性测定方法具有较大的应用价值。实验条件下，通过液体培养的方式测定天然产物对厌氧菌的抗菌活性的方法为浊度法，即将细菌加入到含有天然产物的培养基中进行培养，通过分光光度计或者肉眼观察抑菌圈来进行抗菌活性的筛选。天然产物尤其是粗提物所含的化合物复杂，溶解性较差，在培养基中多呈现出浑浊的状态，与细菌菌体自身的浊度相似而造成浊度法测定不准确，其较深的颜色也会对结果造成不利影响。当天然产物的活性较大时，会出现测定液的浊度较低，分光光度计反应不灵敏、线性不好的现象。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，提出了一种天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法，此方法避免了天然产物本身的溶解性和颜色带来的结果不准确的问题，且操作简单，测定精度高，线性响应灵敏；且可应用于药物的抗厌氧菌活性的测定。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术所述的天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法是通过顶空气相色谱法测定天然产物与厌氧菌菌液无氧环境共存培养过程中产生的代谢酸和加入的弱碱中和反应产生的CO2含量，根据得到的CO2含量计算天然产物对厌氧菌生长的抑制率和半数抑制浓度。进一步地，上述测定方法包括以下步骤：(1)确定厌氧菌菌液培养至稳定期的时间；(2)在步骤(1)所述培养时间内确定厌氧菌代谢产生有机酸量，得到完全中和有机酸所需要加入的弱碱量；(3)实验组中将等量的厌氧菌菌液分别与不同浓度的天然产物在灭菌后的顶空瓶中无氧培养至步骤(1)确定的时间；并设置对照组与空白组，所述对照组中不添加天然产物，空白组中只含有与实验组相同量的培养基；(4)培养结束后在实验组、对照组和空白组的顶空瓶加入步骤(2)确定的弱碱量，立即置于顶空进样器中，进行顶空气相色谱分析，采集CO2色谱峰信息；(5)根据采集的CO2色谱峰信息积分CO2色谱峰面积，通过所述CO2色谱峰面积计算得到天然产物对厌氧菌生长的抑制率，根据抑制率计算得到天然产物对厌氧菌生长的半数抑制浓度。优选地，所述顶空瓶内均为无氧环境；所述无氧环境采用先通过氮气或无氧混合气体置换至顶空瓶内达到完全无氧环境，再向顶空瓶中加入相应样品；或先向顶空瓶中加入相应样品再通过氮气或无氧混合气体置换至顶空瓶内达到完全无氧环境。优选地，所述步骤(1)中，取厌氧菌菌液于灭菌后的顶空瓶中，在一定温度下培养不同时间后，用注射器注入足量的碳酸氢钠溶液，置于顶空气相色谱仪中测定CO2的含量，根据得到的CO2含量确定厌氧菌培养至稳定期的时间。优选地，所述步骤(2)中，所述弱碱为碳酸氢钠溶液，取厌氧菌菌液于灭菌后的顶空瓶中在一定温度下培养至稳定期，用注射器注入相同体积不同浓度的碳酸氢钠溶液，于顶空气相色谱仪中测定CO2的含量，根据得到的CO2含量确定完全中和代谢有机酸酸所需加入的碳酸氢钠量。优选地，所述厌氧菌菌液为正常培养代谢产生CO2或有机酸的菌种菌液，所述有机酸与所述弱碱反应生成CO2。优选地，所述天然产物包括动植物、海洋生物、微生物的提取物及以提取的所述天然产物为基础的药物制品。上述的天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法还可应用于药物的抗厌氧菌活性测定。与现有技术比较，本专利技术具有以下优点及有益效果：采用顶空气相色谱测定天然产物与厌氧菌菌液无氧环境共存培养过程中产生的代谢酸与弱碱中和反应生成的CO2含量，根据得到的CO2含量计算天然产物对厌氧菌生长的抑制率和半数抑制浓度；天然产物的抗菌活性用抑制率和半数抑制浓度表示；此方法不需要测定厌氧菌生长的菌落产生的浊度，避免了天然产物本身的溶解性和颜色带来的结果不准确的问题，天然产物本身状态及在培养基中的浊度对CO2的信号无影响，且操作简单，测定精度高，可有效进行天然产物抗菌活性筛选，对天然产物资源活性评价具有重要意义；且本专利技术提供的技术方案可应用于合成药物对厌氧菌抗菌活性的测定。附图说明图1是本专利技术实施例一测定方法的操作示意图；图2是本专利技术实施例一测定方法的流程示意图；图3是本专利技术实施例二确定艰难梭菌(革兰氏阳性菌)和具核梭杆菌(革兰氏阴性菌)培养时间示意图；图4是本专利技术实施例二确定艰难梭菌(革兰氏阳性菌)和具核梭杆菌(革兰氏阴性菌)碳酸氢钠量的示意图；图5是本专利技术实施例二测定的十数樟提取物对艰难梭菌的抗菌抑制率示意图；图6是本专利技术实施例二测定的鼠李提取物对具核梭杆菌的抗菌抑制率示意图；图7是本专利技术实施例三测定的甲硝唑对艰难梭菌的抗菌抑制率示意图；图8是本专利技术实施例三测定的四环素对具核梭杆菌的抗菌抑制率示意图；图9是本专利技术实施例的测定方法得到的抑制率与传统方法(光密度法)得到的抑制率对比示意图；图10是本专利技术实施例的测定方法得到的抑制率与传统方法(光密度法)得到的半数抑制浓度的对比示意图。具体实施方式为了更清楚的说明本专利技术的实施方式，下面将结合附图对本专利技术实施方式作进一步地描述。实施例一本专利技术实施例提供了一种测定天然产物对厌氧菌抗菌活性的方法，采用顶空气相色谱测定天然产物与厌氧菌菌液无氧环境共存培养过程中产生的代谢酸与弱碱中和反应生成的CO2含量，根据得到的CO2含量计算天然产物对厌氧菌生长的抑制率和半数抑制浓度。参照附图1、2，所述的天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法，包括以下步骤：(1)确定厌氧菌菌液培养至稳定期的时间；具体地，取厌氧菌菌液于灭菌后的顶空瓶中，在一定温度下培养不同时间后，用注射器注入足量的碳酸氢钠溶液，置于顶空气相色谱仪中测定CO2的含量，根据得到的CO2含量确定厌氧菌培养至稳定期的时间；所述厌氧菌菌液为正常培养代谢产生CO2或有机酸的菌种菌液，所述有机酸与弱碱反应生成CO2；(2)在所述培养时间内确定厌氧菌代谢产生有机酸量，得到完全中和有机酸所需要加入的弱碱量；具体地，所述弱碱为碳酸氢钠溶液，取厌氧菌菌液于灭菌后的顶空瓶中在一定温度下培养至稳定期，用注射器注入相同体积不同浓度的碳酸氢钠溶液，于顶空气相色谱仪中测定CO2的含量，根据得到的CO2含量确定完全中和代谢有机酸酸所需加入的碳酸氢钠量；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法，其特征是，采用顶空气相色谱法测定天然产物与厌氧菌菌液无氧环境共存培养过程中产生的代谢酸与弱碱中和反应生成的CO

【技术特征摘要】
1.天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法，其特征是，采用顶空气相色谱法测定天然产物与厌氧菌菌液无氧环境共存培养过程中产生的代谢酸与弱碱中和反应生成的CO2含量，根据得到的CO2含量计算天然产物对厌氧菌生长的抑制率和半数抑制浓度。


2.根据权利要求1所述的天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）确定厌氧菌菌液培养至稳定期的时间；
（2）在步骤（1）所述培养时间内确定厌氧菌代谢产生有机酸量，得到完全中和有机酸所需要加入的弱碱量；
（3）实验组中将等量的厌氧菌菌液分别与不同浓度的天然产物在灭菌后的顶空瓶中无氧培养至步骤（1）确定的时间；并设置对照组与空白组，所述对照组中不添加天然产物，空白组中只含有与实验组相同量的培养基；
（4）培养结束后在实验组、对照组和空白组的顶空瓶加入步骤（2）确定的弱碱量，立即置于顶空进样器中，进行顶空气相色谱分析，采集CO2色谱峰信息；
（5）根据采集气相色谱图积分CO2色谱峰面积，通过所述CO2色谱峰面积计算得到天然产物对厌氧菌生长的抑制率，根据抑制率计算得到天然产物对厌氧菌生长的半数抑制浓度。


3.根据权利要求2所述的天然产物对厌氧菌抗菌活性的测定方法，其特征是，所述顶空瓶内均为无氧环境；所述无氧环境采用先通过氮气或无氧混合气体置换至顶空瓶内达到完全无氧环境，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春云，郭明全，李梦辉，
申请(专利权)人：中国科学院武汉植物园，
类型：发明
国别省市：湖北;42