【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种调控高温诱导叶片衰老的高羊茅转录因子fanac047及其应用。
技术介绍
1、高羊茅(festuca arundinacea)又称苇状羊茅，是禾本科羊茅属多年生草本植物，由于其具有抗旱、耐盐碱、耐践踏、抗病、耐涝和容易建坪等诸多优点，被广泛应用于运动场、边坡、公园、公共绿地及土壤生态修复(zhong et al.,2014)。高羊茅还是重要的牧草资源，其营养丰富、产量高、不与农作物争地、争季节，常被选作长期放牧草地的优良牧草之一(牟琼等，2008)。高羊茅原产于欧洲，在我国东北、新疆等地均有分布，是我国长江中上游及以北地区的主要建坪草种之一。相对于其他常用冷季型草种，高羊茅具有相对较强的耐逆性和较长的周年绿期。近年来，高羊茅在我国南方地区，特别是长江中下游地区也备受青睐(余高镜等，2005)。作为典型的冷季型草种，高羊茅的适宜生长温度为15-25℃，当温度高于38℃时，易导致叶片失水褪绿，提前衰老(qian et al.,2020；江海东等，2000)。叶片是高羊茅最主要的观赏和饲用器官，叶片早衰不仅影响高羊茅的草坪质量和观赏价值，也降低其饲草产量和营养价值。然而，近几十年来，由于人类活动及自然因素等综合影响，大范围气候异常现象不断出现，极端高温事件频繁发生，我国长江中下游地区夏季常出现38℃以上高温天气。因此，越夏高温引起的叶片衰老已成为限制高羊茅在长江中下游地区推广利用的最主要因子之一(何霞等，2007)。解决越夏高温引起的叶片早衰这一问题，有望使高羊茅在长江中下游地区实现常绿，是高羊茅育
2、nac(nam/ataf/cuc)家族是植物特有的一类转录因子家族，在叶片衰老中起着不可或缺的作用。anac092、anac029、anac016、anac019、anac059等转录因子正调控植物叶片的衰老(guo and gan,2006；balazadeh et al.,2011；kim et al.,2013；qiu et al.,2015)；而anac042/jub1和anac083在叶片衰老中起负调控作用(wu et al.,2012；yang etal.,2011)。此外，nac转录因子在植物应答高温胁迫中也起到了重要作用。anac019通过激活hsfa1b、hsfa6b、hsfa7a和hsfc1的表达提高拟南芥的耐热性(guan et al.,2014)。jub1在拟南芥的本底抗热性和热胁迫记忆中都起正调控作用(shahnejat-bushehri et al.,2012；wu et al.,2012)。虽然，nac转录因子在调控叶片衰老和高温胁迫应答中均起着重要作用，但其介导高温诱导叶片衰老的分子机制仍有待进一步探究，且在高羊茅中未有高温诱导衰老相关的nac转录因子的研究报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种调控高温诱导叶片衰老的高羊茅转录因子fanac047及其应用。
2、根据前期高羊茅高温、衰老转录组数据，筛选到了一个受长期高温和自然衰老诱导的高羊茅nac转录因子；以‘k-31’为材料并根据高羊茅全长转录组序列设计特异引物克隆获得该基因cds序列；对这个基因编码的蛋白序列进行分析发现它与水稻的osnac047具有较高同源性，因此该基因被命名为fanac047；在高羊茅中过表达fanac047促进了高温诱导的叶片衰老，而利用rnai技术降低内源fanac047的表达则延缓了高温诱导的叶片衰老。
3、为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案如下：
4、本专利技术首先提供了一种调控高温诱导叶片衰老的高羊茅转录因子fanac047，其核苷酸序列如seq id no.1所示，长度为966bp；编码的蛋白由321个氨基酸组成，序列如seqid no.2所示。
5、进一步，本专利技术提供了通过超表达所述fanac04基因获得加速高温诱导叶片衰老的高羊茅植株的应用，通过以下步骤实现：
6、①构建pcambia1305.1-ubq-fanac047过表达载体：将fanac047基因的cds克隆至带有ubq启动子的植物表达载体pcambia1305.1-ubq中；
7、②转化农杆菌：将构建好的pcambia1305.1-ubq-fanac047过表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌eha105；
8、③获得fanac047-oe转基因高羊茅植株：通过愈伤转化法将pcambia1305.1-ubq-fanac047载体的lb和rb区间序列插入高羊茅染色体，通过抗性筛选、dna水平鉴定和表达量鉴定获得过表达fanac047的转基因高羊茅；
9、④高温诱导fanac047-oe转基因高羊茅的叶片衰老表型鉴定：以过表达fanac047的转基因高羊茅为材料，检测分析其在高温胁迫条件下叶片衰老相关生理指标变化，结果显示与野生型高羊茅相比，过表达fanac047促进了转基因高羊茅的叶片衰老。
10、进一步，本专利技术还提供了通过rnai技术获得延缓高温诱导叶片衰老的高羊茅植株的应用，通过以下步骤实现：
11、ⅰ、构建pxu1301-pdkintron-fanac047载体：将fanac047基因特异片段(388bp)的正反互补链分别连接至pxu1301-pdkintron载体中pdk intron序列的两端；
12、ⅱ、转化农杆菌：将pxu1301-pdkintron-fanac047质粒转化农杆菌eha105；
13、ⅲ、获得fanac047-rnai转基因高羊茅植株：通过愈伤转化法将pxu1301-pdkintron-fanac047载体的lb和rb中间片段插入高羊茅染色体，通过抗性筛选、dna水平鉴定和表达量鉴定获得fanac047表达量下调的转基因高羊茅植株；
14、ⅳ、高温诱导fanac047-rnai转基因高羊茅的叶片衰老表型鉴定：以fanac047-rnai转基因高羊茅为材料，检测分析其在高温胁迫条件下叶片衰老相关生理指标变化，结果显示下调fanac047延缓了高温诱导的高羊茅叶片衰老。
15、本专利技术具有下列优点和积极效果：
16、①利用现有的植物基因工程技术，本专利技术首次克隆得到了调控植物耐盐性的高羊茅转录因子fanac047，功能验证发现过表达fanac047促进了转基因高羊茅植株受高温诱导的叶片衰老进程，而通过rnai下调fanac047的表达则延缓了转基因高羊茅植株受高温诱导的叶片衰老进程，说明该基因正调控高温诱导的叶片衰老。
17、②本专利技术提供的fanac047为通过基因工程技术快速、精准培育耐高温延衰高羊茅种质提供了全新的基因资源。
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1.一种调控高温诱导叶片衰老的高羊茅转录因子FaNAC047，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述调控高温诱导叶片衰老的高羊茅转录因子FaNAC047在培育延缓高温诱导衰老的植物中的应用，其特征在于，在通过超表达FaNAC047基因获得加速高温诱导叶片衰老的高羊茅植株的应用；以及通过RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)下调FaNAC047表达获得延缓高温诱导叶片衰老的高羊茅植株的应用。
3.根据权利要求书2所述的在通过超表达FaNAC047基因获得加速高温诱导叶片衰老的高羊茅植株的应用，其特征在于，包括以下步骤：
4.权利要求书2所述的在通过RNAi技术获得延缓高温诱导叶片衰老的高羊茅植株的应用，其特征在于，包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种调控高温诱导叶片衰老的高羊茅转录因子fanac047，其特征在于：核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述调控高温诱导叶片衰老的高羊茅转录因子fanac047在培育延缓高温诱导衰老的植物中的应用，其特征在于，在通过超表达fanac047基因获得加速高温诱导叶片衰老的高羊茅植株的应用；以及通过rna...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈良，曹丽雯，陈瑶，马光婧，蒲军保，肖凯，
申请(专利权)人：中国科学院武汉植物园，
类型：发明
国别省市：
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