大戟科植物中止血活性成分的筛选及其应用制造技术

本发明专利技术公开了大戟科植物中止血活性成分的筛选及其应用，基于超滤质谱技术并以尿激酶型纤溶酶原激活物为关键靶酶，首次筛选出了大戟科植物中环戊酮异香豆素类的止血活性成分短叶苏木酚酸，短叶苏木酚酸对尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物表现出较强的特异性结合，其对尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物的活性抑制（

【技术实现步骤摘要】
大戟科植物中止血活性成分的筛选及其应用


[0001]本专利技术属于先导化合物的药物开发
，具体涉及大戟科植物中止血活性成分的筛选及其应用
。

技术介绍

[0002]血液承担维持生命活动最重要的功能，各种原因所致的出血是人类日常生活或临床干预中最常见和多变的病症之一，大量的失血已成为造成患者死亡极其重要的原因
。
数据表明，至
2030
年，全球与出血性疾病相关的治疗费用将达
8181
亿美元之多
。
仅以我国为例，每年有上亿人次的外科手术及出血患者，为了维持患者生命，止血药物的市场需求极大
。
当前，止血药主要包括蛇毒血凝酶
、
凝血酶原复合物
、
氨甲环酸
、
氧化纤维素和垂体后叶素等
。
然而，这些止血药物在发挥止血功效时存在极大的局限性，如价格昂贵
、
选择性高以及多种副作用等
。
因此，寻找安全
、
有效的止血替代药物是减少出血且挽救患者生命的关键
。
[0003]大戟科植物在我国植物资源丰富，且具有独特的疗效和用途
。
其中，铁苋菜具有收敛止血的功效，在贵州苗族被用于治疗各种出血症候
(
如咯血
、
血尿
、
便血
、
崩漏和外伤性出血等
)
，且以铁苋菜为君药的血愈片已用于临床
。r/>然而，其发挥止血功效的活性成分研究较少，且止血作用机制尚不清楚，这有碍铁苋菜的充分开发利用
。
尿激酶型纤溶酶原激活物
(uPA)
是一种可促进纤溶酶原激活而在止血过程发挥重要作用的丝氨酸蛋白酶
。
靶向抑制尿激酶型纤溶酶原激活物的活性，有利于出血或损伤状态下的止血功效
。
鉴于此，基于止血过程中关键靶酶
—
尿激酶型纤溶酶原激活物从大戟科植物中筛选天然活性止血成分并用于日常或临床止血药物的开发应用是极具前景的
。
[0004]调查发现，大戟科植物中活性成分发现需经过成分分离
、
结构鉴定和活性验证等复杂且费时费力的步骤
。
超滤质谱筛选技术具有快速高效，专属性强等优势，且已公开的内容中没有利用超滤质谱筛选技术从大戟科植物中筛选止血活性成分的应用报道
。
本专利技术基于超滤质谱技术并以尿激酶型纤溶酶原激活物为关键靶酶首次筛选出了大戟科植物中具有止血活性的环戊酮异香豆素类成分，不仅有利于大戟科植物的进一步开发利用，且为止血中药和民族药相关活性成分开发提供借鉴
。

技术实现思路

[0005]本专利技术基于超滤质谱技术并以尿激酶型纤溶酶原激活物为关键靶酶，从大戟科植物中筛选出止血活性成分
‑‑
短叶苏木酚酸，短叶苏木酚酸对尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物具有较强的抑制活性，可用于制备止血药物
。
[0006]本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种筛选大戟科植物中止血活性成分的方法，包括以下步骤：
[0008](1)
将大戟科植物提取物溶液与尿激酶型纤溶酶原激活物溶液共孵育，孵育后的溶液超滤离心，用缓冲溶液洗脱下未与尿激酶型纤溶酶原激活物特异性结合的成分，离心
后将截留在超滤膜的成分进行解离，收集洗脱液并吹干后复溶，得到实验组溶液；同时将失活的尿激酶型纤溶酶原激活物作为对照组，与实验组相同方法处理后得到对照组溶液；
[0009](2)
取上述提取物溶液
、
实验组溶液
、
对照组溶液进行液相色谱
‑
质谱分析，采集出峰数据；
[0010](3)
根据实验组和对照组溶液中不同化合物基峰图的峰面积变化，计算得到提取物中不同化合物与尿激酶型纤溶酶原激活物的特异性结合值，根据特异性结合值筛选出止血活性化合物，所述特异性结合值计算公式如下：
[0011]SB
＝
A
实验
/A
对照
[0012]SB
是尿激酶型纤溶酶原激活物与提取物中不同化合物的特异性结合值，
A
实验
为实验组溶液中不同化合物与尿激酶型纤溶酶原激活物相互作用后基峰图的峰面积，
A
对照
为对照组溶液中不同化合物与失活的尿激酶型纤溶酶原激活物相互作用后基峰图的峰面积
。
[0013]优选地，所述步骤
(1)
中大戟科植物提取物溶液和尿激酶型纤溶酶原激活物溶液孵育温度为
37℃。
[0014]优选地，所述步骤
(1)
中用体积比为
7:3
的甲醇
‑
水溶液将截留在超滤膜的成分进行解离
。
[0015]短叶苏木酚酸在制备止血药物中的应用：短叶苏木酚酸的化学结构如图4所示，在上述筛选方法中短叶苏木酚酸与尿激酶型纤溶酶原激活物的特异性结合值最高
(SB
＝
2.09)
，表现出较强的特异性结合，具有较强的尿激酶型纤溶酶原激活物抑制活性
(IC
50
＝
0.187
±
0.000mM)。
[0016]本专利技术的优点和有益效果是：
[0017]1.
本专利技术基于超滤质谱技术并以尿激酶型纤溶酶原激活物为关键靶酶首次公开了大戟科植物中短叶苏木酚酸的止血活性，具体类型为环戊酮异香豆素类化合物，在大戟科植物中止血成分研究中未有报道
。
短叶苏木酚酸作为一种天然来源的活性成分，可用于日常或制备临床止血药物中的应用
。
[0018]2.
铁苋菜提取物的凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间为
20.78
±
0.22
秒和
75.29
±
5.50
秒，优于阳性对照云南白药
(21.12
±
0.83
秒；
106.76
±
12.22
秒
)。
铁苋菜提取物对尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物的活性抑制
(IC
50
)
为
204.50
±
24.60
μ
g/mL
，优于阳性对照氨甲环酸
(IC
50
＝
258.80
±
18.10
μ
g/mL)。
短叶苏木酚酸对尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物的活性抑制
(IC
50
)
为
0.187
±
0.000mM
，优于阳性对照氨甲环酸
(IC
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
短叶苏木酚酸在制备止血药物中的应用
。2.
一种筛选大戟科植物中止血活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将大戟科植物提取物溶液与尿激酶型纤溶酶原激活物溶液共孵育，孵育后的溶液超滤离心，用缓冲溶液洗脱下未与尿激酶型纤溶酶原激活物特异性结合的成分，离心后将截留在超滤膜的成分进行解离，收集洗脱液并吹干后复溶，得到实验组溶液；同时将失活的尿激酶型纤溶酶原激活物作为对照组，与实验组相同方法处理后得到对照组溶液；（2）取上述提取物溶液
、
实验组溶液
、
对照组溶液进行液相色谱
‑
质谱分析，采集出峰数据；（3）根据实验组和对照组溶液中不同化合物基峰图的峰面积差异，计算得到提取物中不同化合物与尿激酶型纤溶酶原激活物的特异性结合值，根据特异性结合值筛选出止血活性化合物，所述特异性结合值计算公...

【专利技术属性】
技术研发人员：范民霞，陈桂林，胡光万，郭明全，
申请(专利权)人：中国科学院武汉植物园，
类型：发明
国别省市：