快速鉴定核盘菌突变体致病性强弱的方法及快速鉴定植物抗病性的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定核盘菌突变体致病性强弱的方法，以油麦菜为宿主，分别以待鉴定核盘菌突变体和野生型为模板，利用核盘菌对植物叶片进行侵染，将待鉴定核盘菌造成的植物的侵染面积与野生型核盘菌造成的侵染面积进行比较，来判断所待鉴定核盘菌突变体致病性强弱。本发明专利技术方法可以用于核盘菌致病基因的辅助筛选，为后续的基因筛选提供可靠的依据，结果客观、准确性高，抗病性评判依据直观、简洁明了，可做到快速筛选，方便排除大量与致病性无关的突变基因，省时省力。该方法易于操作，可重复性好，适用于大批量的筛选，可用于研究核盘菌‑油菜互作机理研究，进而指导植物（如油菜）抗病性的育种和油料安全生产。不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而加快植物育种进程。

Methods for rapid identification of pathogenicity of Sclerotinia mutants and for rapid identification of plant disease resistance

【技术实现步骤摘要】
快速鉴定核盘菌突变体致病性强弱的方法及快速鉴定植物抗病性的方法
本专利技术属于病原菌致病性鉴定
，具体涉及核盘菌致病性强弱的大批量筛选的方法以及植物抗病性早期大批量筛选的方法。
技术介绍
菌核病是由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary)侵染引起的真菌性病害，该病原菌寄主范围十分广泛，可寄生75个科278个属400多种植物，包括豆类(大豆、豌豆和菜豆)和油料(油菜、向日葵和花生)等重要的双子叶作物，每年在世界范围内造成巨大的经济损失。菌核病是我国油菜主产区最主要的病害，核盘菌对油菜叶片、茎秆、花、角果都能侵染，但危害最大的部位为成株期茎秆，造成茎秆腐烂，因此也称油菜茎腐病。该病害每年导致油菜产量损失10%～20%，发病严重的大田产量损失可达80%。目前全国年产约1400万吨油菜籽，如果按产量损失10%来计算，每年仅菌核病引起的直接经济损失达70亿元左右。该病害还导致油菜种子含油量降低、脂肪酸组分发生变化，严重影响菜籽油的品质。生产上控制油菜菌核病危害的措施包括栽培管理、化学及生物防治和种植抗病品种等。由于该病原菌寄主众多，其菌核在环境中生命力顽强，栽培管理防治效果有限。采用化学及生物防治方法一方面增加了生产成本，容易造成环境污染;另一方面由于对菌核病发病时期把握不准和使用方法不当而影响使用效果。实践证明，培育抗(耐)病油菜品种是防治油菜菌核病最为经济有效的途径。然而，现有的油菜品种及其近缘种中缺乏有效抗源，导致油菜抗菌核病育种进展缓慢。因此，亟需对油菜与核盘菌互作的分子机理进行深入研究，继而创制抗菌核病的油菜新种质。由于核盘菌的严重危害性，早在20世纪60年代，核盘菌的致病性研究就引起了人们的关注。1965年，就报道了草酸和多聚半乳糖醛酸酶在核盘菌致病过程中的作用（BatemanDFandBeerSV.SimultaneousproductionandsynergisticactionofoxalicacidandpolygalacturonaseduringpathogenesisbySclerotiniarolfsii[J].Phytopathology,1965,55:204-211.）。其后，科学家们先后研究了核盘菌细胞壁降解酶类的作用机理。另有专家学者对核盘菌的致病性分化、种群分布等进行研究（JuniorCGL,GomesEV,JuniorML.Geneticdiversityandmycelialcompatibilitygroupsoftheplant-pathogenicfungusSclerotiniasclerotioruminBrazil[J].GeneticsandMolecularResearch,2011,10(2):868-877.）。随着研究的不断深入，人们对核盘菌的致病机理有了更深刻的了解。最近相关研究报道对核盘菌致病对草酸的依赖性提出质疑（LiangXF,LibertiD，LiM，etal．OxaloacetateacetylhydrolasegenemutantsofSclerotiniasclerotiorumdonotaccumulateoxalicacid，butdoproducelimitedlesionsonhostplants［J］．MolPlantPathol，2015，16(6):559－571．）因此，Xu等提出草酸本身并非核盘菌必需的致病因子，而是其提供的酸性pH，该理论被称为pH依赖理论(XuLS，LiuGQ，JiangDH，etal.Sclerotiniasclerotiorum:anevaluationofvirulencetheories［J］．AnnuRevPhytopathol，2018，56:15．1－15.28.)越来越多的研究发现核盘菌的致病并非那么简单，它还拥有其他很多重要的致病因子。Zhu等发现分泌蛋白SSITL能抑制寄主的抗病反应，推测SSITL可能是核盘菌的效应子，发现分泌蛋白Ss－Caf1是核盘菌重要的致病因子，其与侵染时附着胞及菌核的形成有关，还能与寄主的某些未知蛋白互作，诱导寄主细胞死亡。(DerbyshireM，Denton－GilesM，HegedusD，etal．ThecompletegenomesequenceofthephytopathogenicfungusSclerotiniasclerotiorumrevealsinsightsintothegenomearchitectureofbroadhostrangepathogens［J］．GenomeBiolEvol，2017，9(3):593－618；YuY，XiaoJF，ZhuWJ，etal．Ss－Rhs1，asecretoryRhsrepeat－containingprotein，isrequiredforthevirulenceofSclerotiniasclerotiorum［J］．MolPlantPathol，2017，18(8):1052－1061．Yu等（YuY，XiaoJF，ZhuWJ，etal．Ss－Rhs1，asecretoryRhsrepeat－containingprotein，isrequiredforthevirulenceofSclerotiniasclerotiorum［J］．MolPlantPathol，2017，18(8):1052－1061.）发现分泌蛋白SS－Rhs1对核盘菌的致病力、附着胞的形成以及菌核的形成都有着重要作用。Yang等（YangGG，TangLG，GongYD，etal.Acerato-plataninproteinSsCP1targetsplantPＲ1andcontributestovirulenceofSclerotiniasclerotiorum［J］．NewPhytol，2018，217(2):739－755．）发现分泌蛋白SsCP1可在寄主植物的质外体与抗病蛋白PR1互作，降低PR1对核盘菌菌丝的抑制作用，从而利于核盘菌侵染；同时，高浓度的SsCP1可引起寄主细胞坏死，利于获取营养物质。核盘菌的致病过程异常复杂和精细，并非由单一的致病因子介导，目前尚未找到关键的致病因子。人们对核盘菌致病原因已经有了一定的认识和了解，但是对于核盘菌整个致病信号途径以及与植物互作机理研究尚不清楚。通常，在植物上我们都是通过正向遗传学的方法来筛选鉴定基因，对于核盘菌来说我们也可以借用此办法。因此，建立一个快速鉴定核盘菌致病性的体系对后续研究来说很有必要。目前大部分用来研究病原菌致病性的方法都比较繁琐，并且操作较为复杂，耗时较长，还需要进行大量的数据统计，所以就病原菌致病性层面开发出一种可以快速对核盘菌致病性强弱进行鉴定的技术是亟待解决的。病害是危害农业生产的重要因素之一,植物病害的发生往往会造成大范围的粮食减产。因此,防止作物病害的大规模发生对于保障粮食安全具有重要意义。培育抗病品种是抵御作物病害的最为经济、环保的手段之一。寄主植物抵抗病原物侵染和为害的遗传性状。抗病性的表现，是在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速鉴定核盘菌突变体致病性强弱的方法，分别以待鉴定核盘菌突变体和野生型对油麦菜叶片进行侵染，将待鉴定核盘菌造成的植物的侵染面积与野生型核盘菌造成的侵染面积进行比较，来判断所待鉴定核盘菌突变体致病性强弱。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定核盘菌突变体致病性强弱的方法，分别以待鉴定核盘菌突变体和野生型对油麦菜叶片进行侵染，将待鉴定核盘菌造成的植物的侵染面积与野生型核盘菌造成的侵染面积进行比较，来判断所待鉴定核盘菌突变体致病性强弱。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：用于侵染的叶片为油麦菜幼嫩叶片；用于侵染时的所述菌种是在PDA培养基上，24℃条件下培养两天，挑取菌生长边缘3㎜处菌丝进行接种。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：用打孔器打取菌丝；接菌时，叶片为离体培养，且将所述菌种接至叶片背面；接种后，将叶片置于光照培养室中，24℃下16小时光照8小时黑暗处理培养，24℃恒温培养48小时。


4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，肉眼观测侵染面积判断，或者拍照后用ImageJ软件测量具体面积比较来判断。


5.一种早期快速鉴定植物抗病性的检测方法，其特征在于：以待鉴定的植物为模板，利用核盘菌对其叶片进...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏石头，杨程惠子，李威，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43