一种小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法及应用技术

本发明专利技术属于小杂粮粗多酚抑菌活性测定技术领域，公开了一种小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法及应用，进行原料预处理，杂粮粗多酚溶液制备；菌种活化；谷物粗多酚抑菌活性测定；谷物粗多酚MIC确定。本发明专利技术以青稞、紫米、苦荞为材料浸提谷物多酚，选定金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌为目标菌种，以打孔法测定谷物多酚的抑菌圈直径，对半稀释法测定其最小抑菌浓度，比较三种谷物抑菌效果。实验表明，青稞对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，抑菌圈直径为1.2cm，MIC值为1.0mg/mL；紫米、苦荞无较明显抑菌效果。青稞多酚具有作为抑菌剂应用的前景，本发明专利技术为青稞资源的开发利用提供了理论依据。

A method for the determination of antimicrobial activity of crude polyphenols in small grains and its application

【技术实现步骤摘要】
一种小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法及应用
本专利技术属于小杂粮粗多酚抑菌活性测定
，尤其涉及一种小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法及应用。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：小杂粮是小宗粮豆作物的俗称，分布范围广，生育期较短，且含有多种微量营养物质，是人们喜爱的主要食品之一，在食品生产和加工方面具有重要的地位和作用。小杂粮在种植地域及面积上呈现广而大的特点，在种类及品种方面体现了资源丰富的特点，其中包括了青稞、苦荞、紫米、荞麦等。小杂粮一年四季在各地均有种植，主要以春播和秋播为主。小杂粮虽然品种较多、分布较为广泛，但是其产区和品种分布相对集中。近年来，随着人们饮食观念的改变，带来的是拉动了小杂粮的需求，且小杂粮在种植方式上有间套种等栽种优势，使得我省小杂粮的种植面积在逐年上升中。种植面积占全国6.1％，产量占全国7％-11.7％，在粮食产业上有较大的发展潜力。小杂粮的生长特点为耐寒耐贫瘠，而气候的寒冷却导致其长势的矮小，因此小杂粮多与主粮进行间作套种；生长周期过于短造就了其可以很好的利用时间上的茬口，在种植业的资源合理配置及灾年补救粮食生产的主要粮作物之一。谷物在中国的传统饮食文化中占据地位。2500多年前《黄帝内经》中有“五谷为养”之说，即谷物不仅可以满足我们的口腹之欲，而且是我们身体基本营养物质的补给。谷物中不仅含有我们人体所需的基础营养物质，各营养物质的含量还很高，如裸燕麦中的蛋白质、矿物质总量及不饱和脂肪酸含量均居谷物之首；荞麦中蛋白质含量远高于大米、小麦，且含有的八种必须氨基酸含量最为丰富；绿豆中富含氨基酸及矿物质，是一种高蛋白，低脂肪的食物原料。除此之外，还含有诸如β-胡萝卜素、β-葡聚糖、α-维生素E等其他微量化学物质。分析表明，谷类食品可以在一定程度上降低某些疾病的发生，如心血管疾病、II型糖尿病、肥胖和一些癌症。实验分析表明，小杂粮谷物中含有大量的不饱和脂肪酸，其中很多为人体必需脂肪酸，且脂肪酸对于细菌抑制及促进细胞生成和调节脂质代谢等方面有起到作用。说明了小杂粮对改善人们健康有着重要意义。小杂粮中除了含有人体所需的基本营养素以外，还含有大量功能性营养成分诸如多酚和膳食纤维等。膳食纤维被称为第七大营养素的一类物质，是植物中类似碳水化合物的可食用部分。膳食纤维中主要包括的有β-葡聚糖、木质素，纤维素和半纤维素，这些物质对于降低心脏病、II型糖尿病和结肠癌有较好的预防作用，在控制体重及三高风险上也有较好作用。大量的实验分析表明多酚类物质与人体健康存在密切关系。谷物中含有多酚类物质，其中酚酸类物质最为突出，大部分的酚类在体内可以清除多余的自由基。进而减少机体的细胞的损伤延缓衰老。并且酚类物质在抗菌、降血压、降血糖、抗炎、抗肿瘤等方面有着重要作用和意义。酚类化合物是指在芳香烃中苯环上的氢原子被羟基取代所生成的一大类含有酚羟基的化合物，自然界中的酚类大多从植物中来，其主要存在形式有酚酸、类黄酮、木质素和芪类四种。在果蔬及谷物中最为常见的为酚酸，酚酸又可细分为羟基苯甲酸和羟基肉桂酸等。在食物中羟基肉桂酸极易与葡萄糖等发生简单酯化，其常见形式有咖啡酸和阿魏酸等。而羟基苯甲酸在食物中通常以葡糖苷的形式存在，如苯甲酸及原儿茶素是其最常见的存在形式。由两个苯丙素聚合而成的是木质素，其常见形式有五味子甲素和五味子乙素等，具有很强的抗氧化能力且在治疗肿瘤、癌症、炎症等方面啊有一定意义。芪类是以C6-C2-C6为碳骨架的1,2-二苯乙烯，主要包括白藜芦醇、紫檀芪等。黄酮类是由三个碳原子及两个芳香环组合而成的化合物，主要包含花青素、黄烷醇、黄酮、黄烷酮和黄酮醇五类化合物，类黄酮在自然界中广泛存在，其中被人类已经发现的就有5000余种。通常以糖基化或酯化的缀合物形式存在于果蔬、谷物和茶叶等许多可食性植物中。谷物中含有丰富的多酚，如青稞、紫米和苦荞等谷物中含有大量的多酚类物质，对于分析抗氧化性能有显著前景。谷物多酚主要包括酚酸、类黄酮、单宁和原花青素等。酚酸中含量最为丰富的是阿魏酸，阿魏酸对于抗菌、抗氧化、抑制血小板聚集、抗病毒等方面有较好作用。类黄酮则以结合态或者自由态的形式大多存在于果蔬、豆类和茶叶中，在人类饮食中是最为常见的一种，而在谷物中其多存在于谷物的果皮之中。单宁是一种水溶性的小分子酚类化合物，在植物界中广泛存在，是一种极其重要的次级代谢产物，在高粱、红小米和大麦等谷物中均有存在。分析发现荞麦和高粱中酚酸类物质可媲美果蔬，且具有较强的生物活性。现今多酚抑菌分析方向大多为茶多酚抑菌，其抑菌方面有抗菌谱广和对革兰氏阴性菌及阳性菌均有较好的抑制作用的特点，EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯，Epigallocatechingallate)被发现是最有效的抑菌成分，且革兰氏阳性菌相对于阴性菌对EGCG更为敏感。在谷物中多酚抑菌分析方向多为主食类作物，如玉米须及玉米苞叶多酚提取的抑菌分析，玉米苞叶提取物总黄酮及玉米须提取物没食子酸对于部分细菌均有一定的抑制作用。前人分析发现，小杂粮中含有较高的多酚，具有一定的抗氧化活性，但是关于小杂粮的抑菌活性分析鲜有报道，因此本专利技术以云南特色小杂粮为原材料，提取小杂粮多酚，分析对大肠杆菌、李斯特菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性，进一步为小杂粮的多方面开发利用提供科学依据。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术关于小杂粮的抑菌活性分析鲜有报道。不能为小杂粮多酚的进一步应用提供依据。解决上述技术问题的难度：小杂粮多酚不稳定，在提取过程中易被氧化分解，提取过程需要进行严格的低温避光操作。其次，实验过程中所用菌均为制病菌，在操作过程中需要严格遵守实验要求，注意人身安全。解决上述技术问题的意义：明确小杂粮多酚的抑菌活性，为小杂粮多酚的进一步开发和利用给提供理论依据。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法及应用。本专利技术利用小杂粮多酚进行抑菌活性分析，目前关于小杂粮多酚的抑菌活性分析未见报道。本专利技术是这样实现的，一种小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法，所述小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法包括以下步骤：步骤一，原料预处理：将谷物籽粒进行杂质筛选处理后，置于磨粉机中磨粉，得到面粉过筛，备用。步骤二，杂粮粗多酚溶液的制备：依次进行杂粮粗多酚的提取、杂粮粗多酚的纯化、扩散溶剂的选择以及多酚含量的测定。步骤三，菌种活化：取冻存菌液并加入到培养液中，将培养瓶置于恒温振荡培养箱中恒温培养，备用。步骤四，谷物粗多酚抑菌活性测定：将活化好的菌液置于液体培养基中恒温振荡培养后，加入多酚溶液进行抑菌活性测定。步骤五，谷物粗多酚MIC确定：将各浓度的多酚溶液及70％乙醇溶液加入到恒温振荡培养后的菌液中，进行MIC确定。进一步，步骤一中，所述原料预处理的方法为：将采买来的谷物籽粒进行杂质筛选处理，挑除霉变粒、破损粒。将取挑选好的谷物籽粒于磨粉机中磨粉，得到面粉将其过50目筛备用。进一步，步骤二中，所述杂粮粗多酚提取的方法为：取谷物面粉与75％乙醇以料液比为1:20(g:mL)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法，其特征在于，所述小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法包括以下步骤：/n步骤一，原料预处理：将谷物籽粒进行杂质筛选处理后，置于磨粉机中磨粉，得到面粉过筛，备用；/n步骤二，杂粮粗多酚溶液的制备：依次进行杂粮粗多酚的提取、杂粮粗多酚的纯化、扩散溶剂的选择以及多酚含量的测定；/n步骤三，菌种活化：取冻存菌液并加入到培养液中，将培养瓶置于恒温振荡培养箱中恒温培养，备用；/n步骤四，谷物粗多酚抑菌活性测定：将活化好的菌液置于液体培养基中恒温振荡培养后，加入多酚溶液进行抑菌活性测定；/n步骤五，谷物粗多酚MIC的确定：将各浓度的多酚溶液及70％乙醇溶液加入到恒温振荡培养后的菌液中，进行MIC确定。/n

【技术特征摘要】
1.一种小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法，其特征在于，所述小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法包括以下步骤：
步骤一，原料预处理：将谷物籽粒进行杂质筛选处理后，置于磨粉机中磨粉，得到面粉过筛，备用；
步骤二，杂粮粗多酚溶液的制备：依次进行杂粮粗多酚的提取、杂粮粗多酚的纯化、扩散溶剂的选择以及多酚含量的测定；
步骤三，菌种活化：取冻存菌液并加入到培养液中，将培养瓶置于恒温振荡培养箱中恒温培养，备用；
步骤四，谷物粗多酚抑菌活性测定：将活化好的菌液置于液体培养基中恒温振荡培养后，加入多酚溶液进行抑菌活性测定；
步骤五，谷物粗多酚MIC的确定：将各浓度的多酚溶液及70％乙醇溶液加入到恒温振荡培养后的菌液中，进行MIC确定。


2.如权利要求1所述的小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法，其特征在于，步骤一中，所述原料预处理的方法为：
将采买来的谷物籽粒进行杂质筛选处理，挑除霉变粒、破损粒；将取挑选好的谷物籽粒于磨粉机中磨粉得到面粉，并过50目筛备用。


3.如权利要求1所述的小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法，其特征在于，步骤二中，所述杂粮粗多酚提取的方法为：
(1)取谷物面粉与75％乙醇以料液比为1:20(g:mL)混匀；
(2)将谷物面粉溶液装入适宜的容器内，置于超声仪中，超声25min，每隔5min摇晃溶液，再将超声完成的谷物面粉溶液，置于离心机，室温下4000r/min离心10min；
(3)将步骤(2)重复操作3次，合并离心上清，将上清液旋转蒸发，得到浓缩液；
(4)最后用冷冻干燥将浓缩液冻干至成粉末状，取出冲氮气置于-20℃低温下冷藏备用，标记为1号粉，之后3种谷物1号粉均由此方法提取得到。


4.如权利要求1所述的小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法，其特征在于，步骤二中，所述杂粮粗多酚的纯化方法为：
(Ⅰ)取谷物面粉与75％乙醇以料液比为1:20(g:mL)混匀；
(Ⅱ)将谷物面粉溶液装入适宜的容器内，置于超声仪中，超声25min，每隔5min摇晃溶液，将清洗完成的谷物面粉溶液，置于离心机，室温下4000r/min离心10min；
(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)重复操作3次，合并离心上清，将上清液旋转蒸发，旋转浓缩得到浓缩液；再将旋转蒸发得的上清浓缩液与90％的乙醇以料液比为1:4(v:v)混匀，冲氮后置于-20℃冰箱醇沉48h；
(Ⅳ)最后将醇沉好的谷物多酚溶液置于旋转蒸发仪中旋转浓缩，将浓缩液置于冷冻干燥机，冻干至成粉末状，取出冲氮气置于低温下-20℃冷藏备用，标记为2号粉，之后3种谷物1号粉均由此方法提取得到。


5.如权利要求1所述的小杂粮粗多酚抑菌活性测定方法，其特征在于，步骤二中，所述扩散溶剂的选择方法为：
1)称取3份质量各1g的阿魏酸标样粉，按1:10(g:mL)的料液比将阿魏酸标样粉分别溶于70％乙醇、50％甲醇和蒸馏水溶剂中，三种溶液分别标号a，b和c，混合后得到浓度为0.1g/mL的3种阿魏酸溶液；
2)再分别将3种溶液进行对半稀释，a，b，c各取其体积的1/2依次加入同等体积70％乙醇、50％甲醇、蒸馏水，得到浓度为0.05g/ml的阿魏酸溶液；
3)重复以上步...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永强，杨士花，邹青飞，陈壁，朱昱琳，杨明静，阮玲丽，鲁朝凤，任梦，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53