一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法技术

一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，首先将蛋白质样品进行裂解，并从裂解后的样品中各取一份样品分别进行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集阶段中添加ATP探针富集蛋白激酶，最后再分别对富集后的蛋白和肽段进行高效液相色谱‑串联质谱分析，具有蛋白激酶检测率高、灵敏度高，同时为激酶定性定量研究提供新的实验方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法
本专利技术涉及生物监测
，具体涉及一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法。
技术介绍
蛋白激酶可以催化蛋白发生磷酸化反应，从而调节细胞很多生理功能，比如信号转导、代谢调控、DNA损伤修复等，其异常表达与很多疾病比如肿瘤、糖尿病和老年痴呆等密切相关。目前蛋白激酶数量大约有518种，是非常重要的药物靶点，也是目前药物研究的热点。国内外科研院所及医药企事业单位的激酶组研究市场需求比较大，因此，激酶富集和质谱定性定量技术具有重要意义。但是目前的蛋白激酶检测分析方法中，常常由于蛋白激酶的含量不足造成检测灵敏度低、速度慢和经常漏检的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，首先将蛋白质样品进行裂解，并从裂解后的样品中各取一份样品分别进行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集阶段中添加ATP探针富集蛋白激酶，最后再分别对富集后的蛋白和肽段进行高效液相色谱-串联质谱分析，具有蛋白激酶检测率高、灵敏度高，同时为激酶定性定量研究提供新的实验方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，首先将蛋白质样品进行裂解，并从裂解后的样品中各取一份样品分别进行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集阶段中添加ATP探针富集蛋白激酶，最后再分别对富集后的蛋白和肽段进行高效液相色谱-串联质谱分析。根据以上方案，所述的基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，包括如下步骤：步骤S1样品预处理，取待检测细胞样品，提取细胞样品中的蛋白，作为蛋白样品，向提取出的蛋白样品中添加裂解液(Lysisbuffer)，混匀使蛋白变性，将变性蛋白样品溶剂置换为反应缓冲液(ReactionBuffer)，换溶剂后的蛋白样品溶液中加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(Protease/PhosphataseInhibitorCocktail(100X)(1:100稀释))，样品在冰面上放置，从置换溶剂后的蛋白样品溶液中取出两份样品分别进行步骤S2和步骤S3。步骤S2，取步骤S1中获得的其中一份蛋白样品溶液，加入1M的MgCl2溶液，混匀，将1mM的ATP探针(desthiobitin-ATP)溶液加入到蛋白样品溶液中，室温放置8-12min，再加入浓度均为8M的尿素/IP混合裂解液(Urea/IPLysisbuffer)，再加入50％的高容量链霉亲和素琼脂糖树脂(HighCapacityStretavidinAgaroseResin)，旋转混匀，孵育30-90min，离心取出树脂，并重复多次使用浓度均为4M的尿素/IP混合裂解液处理树脂，再取出树脂使用SDT缓冲液提取树脂中的蛋白样品，提取出的蛋白样品再进行FASP酶解，酶解后的样品进行脱盐处理去除酶解液，采用0.1％甲酸溶液复溶脱盐处理的样品，备用；步骤S3，取步骤S1中获得的其中一份蛋白样品溶液，加入1M的MgCl2溶液，混匀，将1mM的ATP探针溶液加入到蛋白样品溶液中，室温放置8-12min，再加入浓度均为8M的尿素/IP混合裂解液，再加入500mM二硫苏糖醇(DTT)，37℃孵育20-40min，加入1M的碘乙酰胺(IAM)，黑暗反应30min，再将样品溶剂替换为含有20mM的三(羟甲基)氨基甲烷的2M尿素溶液(Urea(20mMTris,pH8.0))，再向样品中加入胰蛋白酶(trypsin)酶解12-24h，再加入50％的高容量链霉亲和素琼脂糖树脂，旋转混匀，孵育30-90min，离心取出树脂，并重复多次使用IP裂解液处理树脂(IPLysisbuffer)，再采用PBS溶液清洗树脂，再使用含有0.1％的三氟乙酸的50％乙腈溶液(ACN(0.1％TFA))对树脂进行洗脱，将洗脱液冷冻干燥，用0.1％甲酸溶液复溶脱盐处理的样品，备用；步骤S4，将步骤S2和步骤S3获得的样品分别进行高效液相色谱-串联质谱分析。根据以上方案，所述的步骤S1中的裂解液添加量为体积比1：2＝蛋白样品溶液：裂解液；所述的蛋白样品液置换溶剂具体为通过7KDa的Zeba脱盐离心柱进行溶剂置换。根据以上方案，所述的步骤S1中提取出蛋白样品后和蛋白样品液置换溶剂后使用BCA定量法对蛋白进行定量，同时将置换溶剂后的蛋白样品溶液稀释到2mg/ml，再取出步骤S2和步骤S3的样品。根据以上方案，所述的步骤S2和S3中的MgCl2的用量为10μl，所述的ATP探针的用量为10μl；所述的步骤S2和S3中的尿素/IP混合裂解液的用量为500μl；所述的步骤S2和S3中的高容量链霉亲和素琼脂糖树脂的用量为50μl；所述的步骤S2和步骤S3中孵育后提取树脂的离心条件为1000g离心1min；所述的步骤S2中使用浓度均为4M的尿素/IP混合裂解液处理树脂为向样品中加入500μl尿素/IP混合裂解液，混匀，1000g离心1min；所述的步骤S2中的使用SDT缓冲液提取树脂中的蛋白样品为加入50μl的SDT缓冲液，沸水浴5min，1000g离心1min；所述的步骤S2中酶解后的样品采用MCX萃取柱进行脱盐。根据以上方案，所述的步骤S3中的二硫苏糖醇的用量为10μl，所述的碘乙酰胺的用量为40μl；所述的步骤S3中黑暗反应后，采用Zeba脱盐离心柱置换溶剂；所述的步骤S3中使用IP裂解液处理树脂为向样品中加入500μl的IP裂解液，混匀，1000g离心1min；所述的步骤S3中的采用PBS溶液清洗树脂为向样品中加入500μlPBS溶液，混匀后以1000g离心1min。根据以上方案，所述的步骤S4中的高效液相色谱条件为是，缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸的84％乙腈水溶液；色谱柱以95％的A液平衡；流速为250nl/min；液相梯度如下：0min-42min，B液线性梯度从5％到23％；42min-50min，B液线性梯度从23％到40％；50min-60min，B液维持在100％。根据以上方案，所述的步骤S4中的串联质谱条件是，分析时长：60min，检测方式：正离子检测，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：60,000atm/z200，最大增益控制：1e6，一级最大进样时间(一级MaximumIT)：50ms，扫描范围数目(Numberofscanranges)：1，动态排除时间(Dynamicexclusion)：30.0s；二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后采集20个碎片图谱(MS2scan)，MS2解离模式(MS2ActivationType)：高能碰撞解离(HCD)，隔离窗口(Isolationwindow)：1.5m/z，二级质谱分辨率：15,000atm/z200，Microscans：1，二级最大进样时间(二级MaximumIT)：50ms，碰撞能量(Normalizedcollisionenergy)：27eV，最小填充比(U本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，其特征在于，首先将蛋白质样品进行裂解，并从裂解后的样品中各取一份样品分别进行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集阶段中添加ATP探针富集蛋白激酶，最后再分别对富集后的蛋白和肽段进行高效液相色谱-串联质谱分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，其特征在于，首先将蛋白质样品进行裂解，并从裂解后的样品中各取一份样品分别进行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集阶段中添加ATP探针富集蛋白激酶，最后再分别对富集后的蛋白和肽段进行高效液相色谱-串联质谱分析。


2.根据权利要求1所述的基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，包括如下步骤：
步骤S1样品预处理，取待检测细胞样品，提取细胞样品中的蛋白，作为蛋白样品，向提取出的蛋白样品中添加裂解液，混匀使蛋白变性，将变性蛋白样品溶剂置换为反应缓冲液，换溶剂后的蛋白样品溶液中加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物，样品在冰面上放置，从置换溶剂后的蛋白样品溶液中取出两份样品分别进行步骤S2和步骤S3。
步骤S2，取步骤S1中获得的其中一份蛋白样品溶液，加入1M的MgCl2溶液，混匀，将1mM的ATP探针溶液加入到蛋白样品溶液中，室温放置8-12min，再加入浓度均为8M的尿素/IP混合裂解液，再加入50％的高容量链霉亲和素琼脂糖树脂，旋转混匀，孵育30-90min，离心取出树脂，并重复多次使用浓度均为4M的尿素/IP混合裂解液处理树脂，再取出树脂使用SDT缓冲液提取树脂中的蛋白样品，提取出的蛋白样品再进行FASP酶解，酶解后的样品进行脱盐处理去除酶解液，采用0.1％甲酸溶液复溶脱盐处理的样品，备用；
步骤S3，取步骤S1中获得的其中一份蛋白样品溶液，加入1M的MgCl2溶液，混匀，将1mM的ATP探针溶液加入到蛋白样品溶液中，室温放置8-12min，再加入浓度均为8M的尿素/IP混合裂解液，再加入500mM二硫苏糖醇，37℃孵育20-40min，加入1M的碘乙酰胺，黑暗反应30min，再将样品溶剂替换为含有20mM的三(羟甲基)氨基甲烷的2M尿素溶液，再向样品中加入胰蛋白酶酶解12-24h，再加入50％的高容量链霉亲和素琼脂糖树脂，旋转混匀，孵育30-90min，离心取出树脂，并重复多次使用IP裂解液处理树脂，再采用PBS溶液清洗树脂，再使用含有0.1％的三氟乙酸的50％乙腈溶液对树脂进行洗脱，将洗脱液冷冻干燥，用0.1％甲酸溶液复溶脱盐处理的样品，备用；
步骤S4，将步骤S2和步骤S3获得的样品分别进行高效液相色谱-串联质谱分析。


3.根据权利要求2所述的基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，其特征在于，所述的步骤S1中的裂解液添加量为体积比1：2＝蛋白样品溶液：裂解液；所述的蛋白样品液置换溶剂具体为通过7KDa的Zeba脱盐离心柱进行溶剂置换。


4.根据权利要求2所述的基于ATP探针富集激酶技术的蛋白质组研究方法，其特征在于，所述的步骤S1中提取出蛋白样品后和蛋白样品液置换溶剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：张益，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31