基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种基于UPLC‑MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，采用液相色谱‑质谱联用技术手段，针对性的对参与能量代谢通路的关键代谢物进行定量检测，尤其是针对在TCA循环、糖酵解和氧化磷酸化通路的关键代谢物，该方法简单快速准确，免去了衍生化实验的繁琐，检测时不仅使用液相色谱发进行分离，同时采用质谱多反应监测模式的高特异性、高灵敏度分析策略，可一次进样分析得到多达20种重要能量代谢物的含量，具有高精度、前处理简单、灵敏度高、重复性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法
本专利技术涉及生物技术检测领域，具体涉及一种基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法。
技术介绍
能量代谢维持着生命体最基本的生命活动，比如植物逆境和动物疾病通常伴随着严重的代谢紊乱，且大多归咎于能量代谢紊乱。能量代谢也影响着免疫细胞的功能和命运，与抗病和免疫应答有关。同时，蛋白质磷酸化的修饰基团来自于ATP，所以能量代谢异常可进一步导致上游蛋白质磷酸化通路的改变，严重影响生物体的各项生理、病理功能。生物体内的能量代谢过程主要包括三羧酸循环、糖酵解途径和氧化磷酸化过程。三羧酸循环(tricarboxylicacidcycle)，又称为柠檬酸循环或TCA循环或Krebs循环，是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，分布在线粒体中；是三大营养素(糖类、脂类、氨基酸)的最终代谢通路；又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。糖酵解途径(glycolyticpathway)又称EMP途径，是将葡萄糖和糖原降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解的途径。EMP途本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤S1构建标准曲线，分别称取能量代谢物标准品，再使用50％乙腈水溶液配制成系列梯度浓度的能量代谢物标准品混合液，标准品混合液直接进行步骤S3和S4获得标准曲线；/n步骤S2样品制备，取待测组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇/乙腈混合液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，真空干燥，备用；/n步骤S3液相色谱分析，取用乙腈水溶液复溶步骤S2获得的干燥样品，离心取上清进行液相色谱分析，色谱条件如下：/n4℃进样，柱温45℃，流速为300μL/min；液相梯度如下：0-12min，B...

【技术特征摘要】
1.基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1构建标准曲线，分别称取能量代谢物标准品，再使用50％乙腈水溶液配制成系列梯度浓度的能量代谢物标准品混合液，标准品混合液直接进行步骤S3和S4获得标准曲线；
步骤S2样品制备，取待测组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇/乙腈混合液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，真空干燥，备用；
步骤S3液相色谱分析，取用乙腈水溶液复溶步骤S2获得的干燥样品，离心取上清进行液相色谱分析，色谱条件如下：
4℃进样，柱温45℃，流速为300μL/min；液相梯度如下：0-12min，B液从95％线性变化到76％；12-12.1min，B液从76％线性变化到47％；12.1-15.1min，B液从47％线性变化到95％，15.1-22min，B液维持在95％；
步骤S4质谱分析，步骤S3中色谱分离的样品直接进入质谱分析，质谱条件是，采用ESI源，离子源温度：450℃；雾化气压：45；辅助气压：45；气帘气：30；喷雾电压:-4500V，采用多反应监测模式检测。


2.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S1中的系列梯度浓度范围是1-50000ng/mL；所述的能量代谢物标准品包括乌头酸、二磷酸腺苷、α-酮戊二酸、一磷酸腺苷、三磷酸腺苷、柠檬酸、环腺苷酸、黄素单核苷酸、延胡索酸、5'-二磷酸鸟苷、5'-鸟苷酸、5'-三磷酸鸟苷、异柠檬酸、苹果酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、琥珀酸和磷酸三苯酯。


3.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中的水和甲醇/乙腈混合液先预冷至温度为4℃，所述的水为超纯水，所述的甲醇/乙腈混合液为体积比1：1的混合液，所述的超声波处理为350W处理20min，所述的孵育沉淀蛋白是-20℃孵育1h。


4.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S2和步骤S3的离心是14000rcf4℃离心15min。


5.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S3中的使用50％的乙腈复溶干燥样品；所述的步骤S3中的A液为10mM的乙酸铵水溶液，pH9.2；所述的B液是10mM乙酸铵水溶液溶于85％乙腈水溶液，pH9.2。


6.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S4中质谱分析的代谢物定量离子对、定性离子对，及其相应的碰撞能信息如下：


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【专利技术属性】
技术研发人员：张惠萍，刘泰驿，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31