基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种基于UPLC‑MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，采用液相色谱‑质谱联用技术手段，针对性的对参与能量代谢通路的关键代谢物进行定量检测，尤其是针对在TCA循环、糖酵解和氧化磷酸化通路的关键代谢物，该方法简单快速准确，免去了衍生化实验的繁琐，检测时不仅使用液相色谱发进行分离，同时采用质谱多反应监测模式的高特异性、高灵敏度分析策略，可一次进样分析得到多达20种重要能量代谢物的含量，具有高精度、前处理简单、灵敏度高、重复性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法
本专利技术涉及生物技术检测领域，具体涉及一种基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法。
技术介绍
能量代谢维持着生命体最基本的生命活动，比如植物逆境和动物疾病通常伴随着严重的代谢紊乱，且大多归咎于能量代谢紊乱。能量代谢也影响着免疫细胞的功能和命运，与抗病和免疫应答有关。同时，蛋白质磷酸化的修饰基团来自于ATP，所以能量代谢异常可进一步导致上游蛋白质磷酸化通路的改变，严重影响生物体的各项生理、病理功能。生物体内的能量代谢过程主要包括三羧酸循环、糖酵解途径和氧化磷酸化过程。三羧酸循环(tricarboxylicacidcycle)，又称为柠檬酸循环或TCA循环或Krebs循环，是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，分布在线粒体中；是三大营养素(糖类、脂类、氨基酸)的最终代谢通路；又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。糖酵解途径(glycolyticpathway)又称EMP途径，是将葡萄糖和糖原降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解的途径。EMP途径为生物体提供一定的能量，其中间产物为生物合成提供原料。氧化磷酸化过程，存在于真核细胞的线粒体或细菌中，是物质在体内氧化时释放的能量供给ADP与无机磷合成ATP的偶联反应。因此，能够全面直观的分析多种生物样本种与能量代谢通路相关代谢物含量，对研究与能量代谢紊乱相关疾病的生理、病理具有积极的指导意义。目前能量代谢通路的关键物质的分析策略主要有三种，一种是对待测样品进行衍生化处理后再用气相色谱-三重四级杆质谱联用分析(中国专利CN106855551A)，由于该方法采用气相色谱进行分离，在检测前需要先用甲氧胺吡啶溶液重悬样品，再加入N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺进行衍生化反应才能进行色谱分离，导致样品制备时间过长，仅仅衍生化反应实验就要耗时至少3小时；第二种是使用带有二极管阵列检测器的高压液相色谱仪进行检测(中国专利CN108303475A)，该方法采用的二极管阵列检测器，灵敏度较差，仅能达到μg/mL级别，且该方法通过与标准品的色谱保留时间进行对比来对待测物进行定性，准确性较差，若检测样本过于复杂，就有可能出现干扰物来影响物质的定性分析，因此它无法成为一种能被广泛应用于多种样本类型的能量物质检测方法；第三种是采用商业化的试剂盒进行相关代谢物的检测，该方法检测费用高昂，实验步骤繁琐，对实验员的操作熟练度要求极高，且每次实验仅能进行单一物质的检测，具有很强的局限性。
技术实现思路
基于现有技术存在上述问题，本专利技术的目的是提供一种基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，采用液相色谱-质谱联用技术手段，针对性的对参与能量代谢通路的关键代谢物进行定量检测，尤其是针对在TCA循环、糖酵解和氧化磷酸化通路的关键代谢物，该方法简单快速准确，免去了衍生化实验的繁琐，检测时不仅使用液相色谱发进行分离，同时采用质谱多反应监测模式的高特异性、高灵敏度分析策略，可一次进样分析得到多达20种重要能量代谢物的含量，具有高精度、前处理简单、灵敏度高、重复性好等优点。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，包括如下步骤：步骤S1构建标准曲线，分别称取能量代谢物标准品，再使用50％乙腈水溶液配制成系列梯度浓度的能量代谢物标准品混合液，标准品混合液直接进行步骤S3和S4获得标准曲线；步骤S2样品制备，取待测组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇/乙腈混合液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，真空干燥，备用；步骤S3液相色谱分析，取用乙腈水溶液复溶步骤S2获得的干燥样品，离心取上清进行液相色谱分析，色谱条件如下：4℃进样，柱温45℃，流速为300μL/min；液相梯度如下：0-12min，B液从95％线性变化到76％；12-12.1min，B液从76％线性变化到47％；12.1-15.1min，B液从47％线性变化到95％，15.1-22min，B液维持在95％；步骤S4质谱分析，步骤S3中色谱分离的样品直接进入质谱分析，质谱条件是，采用ESI源，离子源温度(sourcetemperature)450℃；雾化气压(ionSourceGas1(Gas1))：45；辅助气压(IonSourceGas2(Gas2))：45；气帘气(Curtaingas(CUR))：30；喷雾电压(ionSaparyVoltageFloating(ISVF)):-4500V，采用多反应监测模式检测。根据以上方案，所述的步骤S1中的系列梯度浓度范围是1-50000ng/mL；所述的能量代谢物标准品包括乌头酸、二磷酸腺苷、α-酮戊二酸、一磷酸腺苷、三磷酸腺苷、柠檬酸、环腺苷酸、黄素单核苷酸、延胡索酸、5'-二磷酸鸟苷、5'-鸟苷酸、5'-三磷酸鸟苷、异柠檬酸、苹果酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、琥珀酸和磷酸三苯酯。根据以上方案，所述的步骤S2中的水和甲醇/乙腈混合液先预冷至温度为4℃，所述的水为超纯水，所述的甲醇/乙腈混合液为体积比1：1的混合液，所述的超声波处理为350W处理20min，所述的孵育沉淀蛋白是-20℃孵育1h。根据以上方案，所述的步骤S2和步骤S3的离心是14000rcf4℃离心15min。根据以上方案，所述的步骤S3中的使用50％的乙腈复溶干燥样品；所述的步骤S3中的A液为10mM的乙酸铵水溶液，pH9.2；所述的B液是10mM乙酸铵水溶液溶于85％乙腈水溶液，pH9.2。根据以上方案，所述的步骤S4中质谱分析的代谢物定量离子对、定性离子对，及其相应的碰撞能信息如下：选择特异性好的离子对作为定量离子对，并辅以定性离子对，表中的DP是去簇电压(Declusteringpotential)、CE是碰撞能量(Collisionenergy)、CXP是碰撞室出口电压(Collisioncellexitpotential)。本专利技术的有益效果是：1)采用液相色谱-质谱联用技术手段，方法简单快速准确，免去了衍生化实验的繁琐；2)采用质谱多反应监测模式的高特异性、高灵敏度分析策略，可一次进样分析得到多达20种重要能量代谢物的含量，具有高精度、前处理简单、灵敏度高、重复性好等优点。附图说明图1是实施例中的能量代谢标准品混合物XIC图谱；图2是实施例中的小鼠心脏组织样品的TIC图谱。附图为实施例中必然出现的实验结果图，每次实验的结果图谱会因每次实际实验的差异而发生变法，图中的文字不清晰不会影响本技术方案的重复实施。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术的技术方案进行说明。基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，在本实施例中的待检测样品是小鼠心脏，包括如下步骤：步骤S1构建标准曲线，分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤S1构建标准曲线，分别称取能量代谢物标准品，再使用50％乙腈水溶液配制成系列梯度浓度的能量代谢物标准品混合液，标准品混合液直接进行步骤S3和S4获得标准曲线；/n步骤S2样品制备，取待测组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇/乙腈混合液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，真空干燥，备用；/n步骤S3液相色谱分析，取用乙腈水溶液复溶步骤S2获得的干燥样品，离心取上清进行液相色谱分析，色谱条件如下：/n4℃进样，柱温45℃，流速为300μL/min；液相梯度如下：0-12min，B液从95％线性变化到76％；12-12.1min，B液从76％线性变化到47％；12.1-15.1min，B液从47％线性变化到95％，15.1-22min，B液维持在95％；/n步骤S4质谱分析，步骤S3中色谱分离的样品直接进入质谱分析，质谱条件是，采用ESI源，离子源温度：450℃；雾化气压：45；辅助气压：45；气帘气：30；喷雾电压:-4500V，采用多反应监测模式检测。/n

【技术特征摘要】
1.基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1构建标准曲线，分别称取能量代谢物标准品，再使用50％乙腈水溶液配制成系列梯度浓度的能量代谢物标准品混合液，标准品混合液直接进行步骤S3和S4获得标准曲线；
步骤S2样品制备，取待测组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇/乙腈混合液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，真空干燥，备用；
步骤S3液相色谱分析，取用乙腈水溶液复溶步骤S2获得的干燥样品，离心取上清进行液相色谱分析，色谱条件如下：
4℃进样，柱温45℃，流速为300μL/min；液相梯度如下：0-12min，B液从95％线性变化到76％；12-12.1min，B液从76％线性变化到47％；12.1-15.1min，B液从47％线性变化到95％，15.1-22min，B液维持在95％；
步骤S4质谱分析，步骤S3中色谱分离的样品直接进入质谱分析，质谱条件是，采用ESI源，离子源温度：450℃；雾化气压：45；辅助气压：45；气帘气：30；喷雾电压:-4500V，采用多反应监测模式检测。


2.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S1中的系列梯度浓度范围是1-50000ng/mL；所述的能量代谢物标准品包括乌头酸、二磷酸腺苷、α-酮戊二酸、一磷酸腺苷、三磷酸腺苷、柠檬酸、环腺苷酸、黄素单核苷酸、延胡索酸、5'-二磷酸鸟苷、5'-鸟苷酸、5'-三磷酸鸟苷、异柠檬酸、苹果酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、琥珀酸和磷酸三苯酯。


3.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中的水和甲醇/乙腈混合液先预冷至温度为4℃，所述的水为超纯水，所述的甲醇/乙腈混合液为体积比1：1的混合液，所述的超声波处理为350W处理20min，所述的孵育沉淀蛋白是-20℃孵育1h。


4.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S2和步骤S3的离心是14000rcf4℃离心15min。


5.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S3中的使用50％的乙腈复溶干燥样品；所述的步骤S3中的A液为10mM的乙酸铵水溶液，pH9.2；所述的B液是10mM乙酸铵水溶液溶于85％乙腈水溶液，pH9.2。


6.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S4中质谱分析的代谢物定量离子对、定性离子对，及其相应的碰撞能信息如下：


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【专利技术属性】
技术研发人员：张惠萍，刘泰驿，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31