一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法技术

一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其先以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库，再取抗体药样品结合宿主细胞蛋白数据库进行分析，抗体药样品分析包括取抗体药样品并向其中加入内标标准蛋白作为参比，进行数据非依赖性采集的质谱分析，定量检测抗体药品中的宿主细胞蛋白；所述的宿主细胞蛋白数据库能用于后续相同宿主细胞的抗体药检测，具有成分明确、杂质含量明确、通量高、速度快等优势，为抗体药中杂质蛋白检测开辟了一条新的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法。
技术介绍
单克隆抗体药物在肿瘤、风湿性关节炎、自身免疫性疾病等方面有着独特疗效，在临床上应用越来越广泛。宿主细胞蛋白(HostCellProteins,HCPs)是抗体药中的主要杂质之一，主要来自于宿主细胞的分泌蛋白和死亡宿主细胞的结构蛋白。痕量的杂质蛋白残留可能会在人体产生严重的免疫反应，因此生物药物制品中所含杂质蛋白成分和质量控制非常重要。目前HCPs检测主要通过Elisa方法，但该方法检测成分不明确、假阳性高等缺点。因此，开发出一种可以进行宿主细胞蛋白定性定量的方法尤为迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其先以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库，再取抗体药样品结合宿主细胞蛋白数据库进行分析，抗体药样品分析包括取抗体药样品并向其中加入内标标准蛋白作为参比，进行数据非依赖性采集的质谱分析，定量检测抗体药品中的宿主细胞蛋白；所述的宿主细胞蛋白数据库能用于后续相同宿主细胞的抗体药检测，具有成分明确、杂质含量明确、通量高、速度快等优势，为抗体药中杂质蛋白检测开辟了一条新的途径。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其先以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库，再取抗体药样品结合宿主细胞蛋白数据库进行分析，抗体药样品分析包括取抗体药样品并向其中加入内标标准蛋白作为参比，进行数据非依赖性采集的质谱分析，定量检测抗体药品中的宿主细胞蛋白；所述的宿主细胞蛋白数据库能用于后续相同宿主细胞的抗体药检测。根据以上方案，所述的以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库包括如下步骤：步骤S11，取标准品蛋白并混合均匀，得标准蛋白混合液，再将标准蛋白混合液加入到宿主细胞蛋白样品中；步骤S12，取步骤S11获得的宿主细胞蛋白样品加入1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(Tris-HCl)和胰蛋白酶(Trypsin)进行酶解，酶解后加入1M的二硫苏糖醇(DTT)孵育，再离心取上清液；步骤S13，取步骤S12中获得的上清液加入20％三氟乙酸(TFA)，将pH调至2-3，再取上清液进行高pH反相色谱分馏，将混合物分成多个级别的组分，每个组分均冷冻干燥，再用1％甲酸(FA)复溶，再加入iRT标准肽段后进行高效液相色谱-串联质谱分析，分析质谱数据并建立宿主细胞蛋白数据库；所述的串联质谱条件为：分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：60,000(@m/z200)，最大增益控制(AGCtarget)：3e6，一级最大进样时间(一级MaximumIT)：25ms；肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后触发采集20个二级质谱图谱(MS2scan)，二级质谱分辨率：15,000atm/z200，最大增益控制(AGCtarget):1e5，二级最大进样时间(二级MaximumIT)：50ms，MS2解离模式(MS2ActivationType):高能碰撞解离(HCD)，隔离窗口(Isolationwindow)：1.5Th，碰撞能量(Normalizedcollisionenergy)：27。根据以上方案，所述的抗体药样品分析包括如下详细步骤：步骤S21，取标准品蛋白并混合均匀，得标准蛋白混合液，再将标准蛋白混合液加入到抗体药样品中；步骤S22，取抗体药样品加入1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(Tris-HCl)和胰蛋白酶(Trypsin)进行酶解，酶解后加入1M的二硫苏糖醇(DTT)孵育，再离心取上清液；步骤S23，取步骤S22中获得的上清液加入20％三氟乙酸(TFA)，将pH调至2-3，再将上清夜进行脱盐处理，冷冻干燥，再用1％甲酸(FA)复溶，再加入iRT标准肽段后进行高效液相色谱-串联质谱分析；所述的质谱分析条件是：分析时长：120min，检测模式：正离子；一级质谱扫描范围：350-1650m/z，质谱分辨率：120,000(@m/z200)，最大增益控制(AGCtarget)：3e6，一级最大进样时间(一级MaximumIT)：50ms；MS2采用数据非依赖性采集(DIA)模式，设置30个DIA采集窗口，二级质谱分辨率：30,000(@m/z200)，最大增益控制(AGCtarget)：3e6，二级最大进样时间(二级MaximumIT)：自动，MS2解离模式(MS2ActivationType):高能碰撞解离(HCD)，碰撞能量(Normalizedcollisionenergy)：25，光谱数据类型(Spectraldatatype):剖面(profile)；步骤S24，使用标准蛋白掺入的摩尔量以及特征信息，绘制标准曲线；根据标准曲线的公式，结合宿主细胞蛋白特征信息计算出宿主细胞蛋白的摩尔数，并通过摩尔数转化为质量，再根据初始进样量计算宿主细胞蛋白的含量。根据以上方案，所述的标准蛋白混合液包括100ppm的溶菌酶(lysozyme)、50ppm的肌红蛋白(myoglobin)、30ppm的乳铁蛋白(Lactoferrin)、15ppm的牛血清白蛋白(BSA)、5ppm的β-酪蛋白(β-Casein)和1ppm细胞色素c(Cytochromec)。根据以上方案，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液的用量为20μL；所述的胰蛋白酶的用量为5μg；所述的酶解条件为37℃酶切反应20h；所述的二硫苏糖醇孵育为加入20μL，100℃孵育10min；所述的离心条件为13000g高速离心30min；所述的三氟乙酸的用量为10μL；所述的甲酸用量为10-15μL。根据以上方案，所述的高效液相色谱的条件为，缓冲液：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为含0.1％甲酸的84％乙腈水溶液，色谱柱以95％的A液平衡；流速为5μL/min，液相分离梯度如下：0min-2min，B相线性梯度从2％-5％；2min-92min，B相线性梯度从5％-25％；92min-100min，B相线性梯度从25％-40％；100min-105min，B相线性梯度从40％-100％并维持至120min。本专利技术的有益效果是：首次运用非数据依赖性采集方法(DIA)结合内标蛋白参比对HCPs进行非标记定量研究，为HCP杂质定量检测提供一种新的方法，较现有的检测方法相比，具有成分明确、杂质含量明确、通量高、速度快等优势。附图说明图1是实施例中的标准曲线图。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术的技术方案进行说明。本实施例中的iRT肽段序列是：LGGNEQVTRYILAGVENSKGTFIIDPGGVIRGTFIIDPAAVIRGAGSSEPVTGLDAKTPVISGGPYEYRVEATFGVDESNAKTPVITGAPYEYRDGLDAASYYAP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其特征在于，其先以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库，再取抗体药样品结合宿主细胞蛋白数据库进行分析，抗体药样品分析包括取抗体药样品并向其中加入内标标准蛋白作为参比，进行数据非依赖性采集的质谱分析，定量检测抗体药品中的宿主细胞蛋白；所述的宿主细胞蛋白数据库能用于后续相同宿主细胞的抗体药检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其特征在于，其先以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库，再取抗体药样品结合宿主细胞蛋白数据库进行分析，抗体药样品分析包括取抗体药样品并向其中加入内标标准蛋白作为参比，进行数据非依赖性采集的质谱分析，定量检测抗体药品中的宿主细胞蛋白；所述的宿主细胞蛋白数据库能用于后续相同宿主细胞的抗体药检测。


2.根据权利要求1所述的抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其特征在于，所述的以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库包括如下步骤：
步骤S11，取标准品蛋白并混合均匀，得标准蛋白混合液，再将标准蛋白混合液加入到宿主细胞蛋白样品中；
步骤S12，取步骤S11获得的宿主细胞蛋白样品加入1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液和胰蛋白酶进行酶解，酶解后加入1M的二硫苏糖醇孵育，再离心取上清液；
步骤S13，取步骤S12中获得的上清液加入20％三氟乙酸，将pH调至2-3，再取上清液进行高pH反相色谱分馏，将混合物分成多个级别的组分，每个组分均冷冻干燥，再用1％甲酸复溶，再加入iRT标准肽段后进行高效液相色谱-串联质谱分析，分析质谱数据并建立宿主细胞蛋白数据库；
所述的串联质谱条件为：分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：60,000(@m/z200)，最大增益控制：3e6，一级最大进样时间：25ms；肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描后触发采集20个二级质谱图谱，二级质谱分辨率：15,000atm/z200，最大增益控制:1e5，二级最大进样时间：50ms，MS2解离模式:高能碰撞解离，隔离窗口：1.5Th，碰撞能量：27。


3.根据权利要求1所述的抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其特征在于，所述的抗体药样品分析包括如下详细步骤：
步骤S21，取标准品蛋白并混合均匀，得标准蛋白混合液，再将标准蛋白混合液加入到抗体药样品中；
步骤S22，取抗体药样品加入1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液和胰蛋白酶进行酶解，酶解后加入1M的二硫苏糖醇孵育，再离心取上清液；
步骤S23，取步骤S22中获得的上清液加入20％三氟乙酸，将pH调至2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张益，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31