一种基于分子生物学的黑白芝麻检测方法技术

本发明专利技术提供了本发明专利技术通过分子生物学方法(例如，荧光实时PCR和高分辨率熔解曲线分析)来定性鉴别黑芝麻和白芝麻的方法。本发明专利技术还提供了用于鉴别黑芝麻和白芝麻的特异性引物。

A detection method of black and white sesame based on Molecular Biology

【技术实现步骤摘要】
一种基于分子生物学的黑白芝麻检测方法
本专利技术涉及分子生物学领域。具体而言，本专利技术通过分子生物学方法(例如，荧光实时PCR和高分辨率熔解曲线分析)来定性鉴别黑芝麻和白芝麻。
技术介绍
芝麻属胡麻科植物，一年生直立草本植物，它遍布世界上的热带地区以及部分温带地区，种子卵形，两侧扁平，黑色、白色或淡黄色。其中以黑芝麻和白芝麻为主。芝麻含有多种营养成分，具有很高的营养价值和食用功能价值，其用途较广泛，不但是一种油料种子，也是药材和食材。黑芝麻药食两用，自古以来就被认为是养生保健的佳品。然而，同为胡麻科的白芝麻在众多医药宝典中没有医疗价值的记录，人们一直认为黑芝麻比白芝麻等其他颜色的芝麻更有益于人体健康。研究表明，黑芝麻的游离态、结合态和总多酚及黄酮含量均比白芝麻的含量高，值得注意的是，多酚及黄酮与抗氧化活性存在显著相关性，因此，黑芝麻的总抗氧化能力高于白芝麻[1]。黑芝麻中含有的黑色素对温度、光照有很好的耐受性，受氧化剂、还原剂、抗坏血酸、防腐剂和酸化剂的影响较小，是优良的天然色素来源。黑色素还有显著的光保护下抗氧化还原性和干扰体内病毒形成等生理活性，显示出黑芝麻独特的作用[2]。现在市场出现很多假冒黑芝麻，经过商贩的加工染色，拿到市场销售，蒙骗消费者。董维卿[3]等从形态特征和薄层色谱两方面区分出黑芝麻和地肤种子。江新永[4]提出了用直接水洗法、白纱布水浸出法、滤纸层析鉴别法3种方法来鉴别染色黑芝麻，为防止染色黑芝麻出口提供了一条简单快速可行的方法。虽然这些方法简单、易操作，但是其受主观影响较大，而且芝麻的化学成分容易受到芝麻生长环境和储藏条件的影响，因此根据理化性质来检测芝麻的种皮颜色有一定的局限性。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人发现，黑芝麻和白芝麻的olea基因上存在有两个位点的碱基差异(即SEQIDNO:6的第99位、和第138位核苷酸)，因此，可针对上述差异(SEQIDNO:6的第99位和/或第138位核苷酸)，设计合适的引物，以待鉴定的芝麻中提取的DNA为模板，进行PCR扩增，再对扩增产物进行分析即可鉴别出黑白芝麻。具体而言，本专利技术的专利技术人利用分子生物学方法区分黑白芝麻，从芝麻中提取足量高质量的DNA，用根据芝麻种皮特异性基因相关序列设计的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再对扩增产物进行分析，例如高分辨率熔解曲线(HighResolutionMelting，HRM)分析或测序分析，就能对芝麻种皮颜色进行判断。这种方法的优势在于可以定性鉴别出黑白芝麻，且不受地域、环境、脂肪酸比例带来的影响。第一方面，本专利技术提供了用于PCR扩增的引物，所述引物用于特异性扩增SEQIDNO:6或其包含的子序列，其中所述子序列包含SEQIDNO:6的第99位和/或第138位核苷酸并且长度不小于50bp。第二方面，本专利技术提供了一种PCR试剂盒，所述试剂盒包含第一方面的引物。第三方面，本专利技术提供了第一方面的引物用于鉴别黑芝麻和白芝麻的用途或用于制备用于鉴别黑芝麻和白芝麻的检测试剂的用途。第四方面，本专利技术提供了一种用于鉴别黑芝麻和白芝麻的方法，所述方法包括：(1)提取芝麻种子DNA；(2)以提取的DNA为模板，第一方面的引物为上下游引物，进行PCR；(3)分析PCR产物。附图说明图1表示使用引物对Sesame-oleaHRMF2和Sesame-olea-HRMR2得到的扩增产物的HRM分析和使用引物对Sesame-olea-black-F和Sesame-olea-black-R获得的PCR产物的测序分析。A为使用Sesame-oleaHRMF2和Sesame-olea-HRMR2的扩增产物HRM分析，其中蓝色线代表黑芝麻样品1、2、3、4、5，绿色线代表白芝麻样品1、2、3、4、5、6。B为使用Sesame-olea-black-F和Sesame-olea-black-R获得的PCR产物测序结果分析。图2表示使用Sesame-oleaHRMF2和Sesame-olea-HRMR2，从市售的芝麻样品得到的扩增产物的HRM分析。图3表示黑芝麻样品6和7的测序结果。A为黑芝麻样品6，B为黑芝麻样品7。具体实施方式一方面，本专利技术提供了用于PCR扩增的引物，所述引物用于特异性扩增SEQIDNO:6或其包含的子序列，其中所述子序列包含SEQIDNO:6的第99位和/或第138位核苷酸并且长度不小于50bp，优选不小于55bp，更优选不小于57bp。优选地，所述引物用于特异性扩增SEQIDNO:5。在具体实施方案中，所述引物的序列如SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4所示。在本领域中，在进行PCR扩增反应时，通常会加入引物对以进行PCR扩增。在本案的一个具体实施方案中，进行PCR扩增时，所使用的引物对包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。在本案的另一个具体实施方案中，进行PCR扩增时，所使用的引物对包括SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。另一方面，本专利技术提供了一种PCR试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术的引物。通常情况下，所述试剂盒中包含合适的引物对。在本案的一个具体实施方案中，所述试剂盒包含的引物对包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。在本案的另一个具体实施方案中，所述试剂盒包含的引物对包括SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。在一个具体实施方案中，所述试剂盒还包含DNA聚合酶、dNTP和无菌水。在另一个具体实施方案中，所述试剂盒为实时荧光PCR试剂盒。另一方面，本专利技术提供了本专利技术的引物用于鉴别黑芝麻和白芝麻的用途或用于制备用于鉴别黑芝麻和白芝麻的检测试剂的用途。在一个具体实施方案中，所述检测试剂是PCR试剂盒，优选为实时荧光PCR试剂盒。再一方面，本专利技术提供了一种用于鉴别黑芝麻和白芝麻的方法，所述方法包括：(1)提取芝麻种子DNA；(2)以提取的DNA为模板，本专利技术的引物为上下游引物，进行PCR；(3)分析PCR产物。在本案的一个具体实施方案中，进行PCR扩增时，所使用的上下游引物包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。在本案的另一个具体实施方案中，进行PCR扩增时，所使用的上下游引物包括SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。在一个具体实施方案中，步骤(3)中的分析PCR产物为将所述PCR产物直接进行高分辨率熔解曲线(HRM)分析。在一个具体实施方案中，步骤(3)中的分析PCR产物为对所述PCR产物进行DNA测序并分析测序结果。在一个具体实施方案中，所述PCR为实时荧光PCR。提取芝麻种子DNA的方法为本领域的常规方法，可采用的方法包括但不限于为：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法、SDS(十二烷基磺酸钠)法、GuSCN(异硫氰酸胍)法，也可以采用试剂盒，例如，天根植物基因组DNA提取试剂盒、TaKaRaMiniBEST通用基因组DNA提取试剂盒进行提取，具体提取过程为本领域的技术人本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于PCR扩增的引物，所述引物用于特异性扩增SEQ ID NO:6或其包含的子序列，其中所述子序列包含SEQ ID NO:6的第99位和/或第138位核苷酸并且长度不小于50bp；优选地，所述引物用于特异性扩增SEQ ID NO:5。/n

【技术特征摘要】
1.用于PCR扩增的引物，所述引物用于特异性扩增SEQIDNO:6或其包含的子序列，其中所述子序列包含SEQIDNO:6的第99位和/或第138位核苷酸并且长度不小于50bp；优选地，所述引物用于特异性扩增SEQIDNO:5。


2.权利要求1的引物，所述引物的序列如SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4所示。


3.一种PCR试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2的引物；优选地，所述试剂盒为实时荧光PCR试剂盒。


4.权利要求3的试剂盒，所述试剂盒还包含DNA聚合酶、dNTP和无菌水。


5.权利要求1或2的引物用于鉴别黑芝麻和白芝麻的用途。


6....

【专利技术属性】
技术研发人员：杨华，肖玲，封莉，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31